鉻離子對人成骨樣細(xì)胞株MG63的毒性與其氧化應(yīng)激關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、氧自由基生物學(xué)是一門新興的學(xué)科，目前的研究發(fā)現(xiàn)氧自由基參與許多疾病的發(fā)病機(jī)制，抗氧化劑又可用于許多與氧自由基損傷有關(guān)的疾病的防治，具有重大的實(shí)用性。因而自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)緊密相聯(lián)，成為一個(gè)十分活躍的研究領(lǐng)域。口腔慢性炎癥性疾病和骨吸收相關(guān)的病理過程都有氧自由基的參與。 牙缺損或缺失后常用金屬或包含金屬的材料進(jìn)行修復(fù)。非貴金屬材料因價(jià)格便宜，又具有良好的機(jī)械性能，在臨床上廣泛運(yùn)用。臨床上經(jīng)?？梢钥吹酱饔眯迯?fù)體一段時(shí)間后出現(xiàn)牙齦著色

2、、增生、紅腫乃至局限性牙周炎或種植體周圍炎的發(fā)生。在各種影響修復(fù)體周圍組織健康的因素中，修復(fù)用合金的影響受到越來越多的關(guān)注。這些合金在口腔潮濕環(huán)境緩慢釋放出金屬離子，一定濃度的金屬離子對口腔軟硬組織可產(chǎn)生毒性作用。近年的研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)過渡金屬離子可能影響單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，引起細(xì)胞的氧化應(yīng)激，進(jìn)而影響細(xì)胞的形態(tài)、增殖和分化。成骨細(xì)胞是參與骨重建的重要細(xì)胞，成骨細(xì)胞的功能狀態(tài)是影響牙周健康的重要因素。有關(guān)金屬離

3、子對成骨細(xì)胞的毒性作用以及與氧化應(yīng)激之間關(guān)系的研究，目前尚未見報(bào)道。鉻離子是修復(fù)用生物合金的基本組分之一，鉻與許多疾病和損傷密切相關(guān)。鉻離子的生物毒性機(jī)制是否與刺激組織細(xì)胞產(chǎn)生活性氧 (reactive oxygen species，ROS),引起氧化應(yīng)激有關(guān)，是學(xué)者們的研究熱點(diǎn)，但具體機(jī)制仍不十分清楚。本課題針對相關(guān)內(nèi)容，以人成骨樣細(xì)胞株MG63為研究對象，分三部分進(jìn)行了探討。 1.氧化應(yīng)激對人成骨樣細(xì)胞MG63活性的影響

4、 利用黃嘌呤/黃嘌呤氧化酶(xanthine/xanthine oxidase，X/XO) 的酶促反應(yīng)生成超氧陰離子自由基刺激MG63細(xì)胞，成功建立了成骨細(xì)胞氧化應(yīng)激模型，運(yùn)用氧化敏感性熒光探針 DCFH-DA結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測了細(xì)胞內(nèi)ROS的生成，用倒置顯微鏡和 MTT 實(shí)驗(yàn)觀察研究氧化應(yīng)激對成骨細(xì)胞形態(tài)和增殖活力的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，X/XO 處理后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯破壞，細(xì)胞增殖活力明顯降低，且隨處理濃度增大、時(shí)間延長，細(xì)胞內(nèi)ROS

5、的生成量越大，細(xì)胞增殖活力降低更明顯。XO的抑制劑Oxypurinol在抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的同時(shí)，也拮抗了X/XO引起的成骨細(xì)胞毒性。提示氧化應(yīng)激可以破壞成骨細(xì)胞形態(tài)，抑制成骨細(xì)胞增殖活力。 2.鉻離子對人成骨樣細(xì)胞MG63的毒性作用 5-20μM 的Cr<'6+>和Cr<'3+>刺激MG63細(xì)胞，定量研究不同價(jià)態(tài)的鉻離子對 MG63細(xì)胞的毒性作用。用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-aeetyl-cysteine，NAC

6、)預(yù)處理細(xì)胞，觀察它們對鉻離子引起的成骨細(xì)胞毒性作用的拮抗效應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Cr<'6+>對MG63細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，抑制成骨細(xì)胞增殖活力和堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性，破壞細(xì)胞正常形態(tài)和亞結(jié)構(gòu)。Cr<'3+>對 MG63 細(xì)胞的活性沒有明顯的影響。1-5mM的抗氧化劑NAC可以抑制Cr<'6+>引起的成骨細(xì)胞毒性。為進(jìn)一步研究氧化應(yīng)激在鉻離子引起的成骨細(xì)胞毒性機(jī)制中的作用提供相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

7、 3 鉻離子作用下的人成骨樣細(xì)胞MG63的氧化應(yīng)激 用5-20μM的鉻離子對MG63細(xì)胞染毒，氧化敏感性熒光探針DCFH-DA結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)及MDA實(shí)驗(yàn)檢測不同價(jià)態(tài)、不同濃度鉻離子對MG63細(xì)胞內(nèi)ROS生成的影響和細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：5-20μM Cr<'6+>染毒1h后細(xì)胞內(nèi)ROS的生成明顯增加，高濃度組比低濃度組ROS生成更多；10μM Cr<'6+>染毒15-120min，引起MG63細(xì)胞內(nèi)ROS的大量

8、生成，且隨著染毒時(shí)間的延長，細(xì)胞內(nèi) ROs的生成量也越多；5-20μM Cr6<'6+>染毒24h和72h引起MG63細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷，cr<'6+>濃度越高、染毒時(shí)間越長，細(xì)胞脂質(zhì)過氧化損傷程度越高；1-5mM的抗氧化劑NAC可以抑制cr<'6+>引起的MG63細(xì)胞內(nèi)ROs的產(chǎn)生和脂質(zhì)過氧化損傷；5-20μM的Cr<'3+>對MG63細(xì)胞內(nèi)ROS的生成和脂質(zhì)過氧化損傷程度無明顯影響。上述結(jié)果提示，Cr<'6+>刺激MG63細(xì)胞內(nèi)RO