甲狀旁腺激素1-34與低滲透壓聯(lián)合調(diào)控成骨樣細(xì)胞MG63生物學(xué)效應(yīng)的研究.pdf

1、隨著人口老齡化問(wèn)題日益嚴(yán)重，口腔修復(fù)患者中原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的老年患者越來(lái)越多。由于骨質(zhì)疏松導(dǎo)致骨量不足、骨密度過(guò)低，不能進(jìn)行正常的種植修復(fù)，或者常規(guī)修復(fù)效果不理想。如何治療和控制骨質(zhì)疏松的發(fā)病，解決因此帶來(lái)的骨量不足，重建骨組織的健康結(jié)構(gòu)和功能，是口腔醫(yī)學(xué)，骨整形、以及骨缺損重建等臨床醫(yī)學(xué)所關(guān)心的問(wèn)題。 甲狀旁腺激素(PTH)是一種重要的體內(nèi)維持鈣穩(wěn)態(tài)及骨代謝的全身性調(diào)節(jié)激素，其靶細(xì)胞為成骨細(xì)胞和腎小管細(xì)胞。2002年12月，F(xiàn)

2、orteo商品名叫特立派汰的人工合成PTH被FDA認(rèn)證，作為治療骨質(zhì)疏松藥物。研究證明，PTH對(duì)依據(jù)給藥方式不同對(duì)骨組織產(chǎn)生雙重作用。小劑量、間斷式甲狀旁腺激素(PTH)皮下注射能有效地促進(jìn)骨骼合成；持續(xù)作用刺激骨轉(zhuǎn)化，增加破骨細(xì)胞的活性和降低皮質(zhì)骨量，導(dǎo)致松質(zhì)骨喪失。PTH主要通過(guò)骨形成的三個(gè)階段發(fā)揮作用的：1，刺激前期成骨細(xì)胞增殖；2，促進(jìn)前期成骨細(xì)胞，但是抑制成熟的成骨細(xì)胞的分化；3，抑制成骨細(xì)胞凋亡。其中是否前期成骨細(xì)胞增殖提高

3、還不是很清楚。PTH對(duì)骨組織的另一重作用是持續(xù)性大劑量注射PTH，則抑制成骨細(xì)胞增殖分化，活化破骨細(xì)胞。 通過(guò)PTH以及應(yīng)力對(duì)成骨細(xì)胞作用機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，二者對(duì)成骨細(xì)胞的影響有很多共同的作用機(jī)理，這預(yù)示PTH和機(jī)械應(yīng)力之間可能有著某種協(xié)同關(guān)系。有關(guān)PTH對(duì)成骨樣細(xì)胞的機(jī)械應(yīng)力響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)研究，目前還未見(jiàn)國(guó)內(nèi)報(bào)道。因此，有必要對(duì)PTH調(diào)控成骨樣細(xì)胞的機(jī)械響應(yīng)機(jī)制作進(jìn)一步的研究，并尋求發(fā)現(xiàn)PTH和機(jī)械應(yīng)力間的內(nèi)在聯(lián)系。目的：

4、 本課題旨在通過(guò)對(duì)體外培養(yǎng)的人成骨樣細(xì)胞MG63，加載不同強(qiáng)度的牽張刺激，通過(guò)測(cè)定不同刺激強(qiáng)度對(duì)該細(xì)胞的線粒體跨膜電位(△Ψm)、ALPase、細(xì)胞增殖及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，初步篩選出一個(gè)牽張閾值；進(jìn)而采用低濃度的甲狀旁腺激素(20ng/ml)，采用間斷和持續(xù)作用于閾上刺激后的人成骨樣細(xì)胞MG63，通過(guò)觀察其礦化結(jié)節(jié)的形成情況，以及采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)人甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PHT/PTHrP)和骨鈣素(OCN)的mRN

5、A表達(dá)情況，初步探討甲狀旁腺激素對(duì)不同機(jī)械力作用下的成骨樣細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。以期探討通過(guò)全身或局部藥物作用，來(lái)影響機(jī)械載荷下的牙槽骨改建，預(yù)防或減緩其吸收。為口腔修復(fù)、種植和正畸臨床醫(yī)學(xué)提供基礎(chǔ)性的研究。 方法： 1．采用低滲透液式加力方式，對(duì)體外培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行牽張刺激。采用不同濃度的甘露醇調(diào)節(jié)低滲透壓的大小，模擬體外細(xì)胞受力的強(qiáng)度。 2．采用人成骨樣細(xì)胞MG63的細(xì)胞株進(jìn)行體外培養(yǎng)，觀察細(xì)胞形態(tài)，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲

6、線為低滲透壓加載實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)細(xì)胞。 3．采用低滲透壓對(duì)體外培養(yǎng)的MG63進(jìn)行加載，通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡觀測(cè)細(xì)胞線粒體形態(tài)，圖像分析軟件分析線粒體跨膜電位的變化；通過(guò)分析ALP以及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化分析低滲透壓對(duì)MG63的影響，初步篩選出一個(gè)低滲透壓閾值，為后期PTH實(shí)驗(yàn)研究準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)條件。 4．采用化學(xué)熒光檢測(cè)技術(shù)，對(duì)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中不同時(shí)間的PTH的免疫活性進(jìn)行藥物動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，分析PTH的代謝特性，并繪制代謝曲線

7、。排除由于PTH代謝導(dǎo)致藥效濃度過(guò)低，可能產(chǎn)生的實(shí)驗(yàn)結(jié)果的偏差。 5.對(duì)閾上刺激后的MG63進(jìn)行低濃度的PTH間斷和連續(xù)刺激，采用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PHT/PTHrP和骨鈣素OCN的mRNA表達(dá)情況。 6.采用茜素紅染色技術(shù)，觀察PTH作用前后的MG63礦化誘導(dǎo)情況，并采用分光光度儀定量檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)的情況。 結(jié)果： 1.通過(guò)對(duì)線粒體膜電位的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓的降低，以及作用的

8、時(shí)間延長(zhǎng)，膜電位有增高的趨勢(shì)，其中277mOsm膜電位輕度增高，但與對(duì)照組沒(méi)有明顯差別(P>0.05)；240mOsm組的膜電位總體高于對(duì)照組(P<0.05)，且作用2h、4h和6h時(shí)，膜電位明顯高于對(duì)照組，在作用4h時(shí)達(dá)到峰值。163mosm在作用初期，就有明顯的膜電位增高，但是隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，膜電位降低，且作用4h以后，已經(jīng)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。 2.通過(guò)MTq、生長(zhǎng)曲線分析發(fā)現(xiàn)所有細(xì)胞均近似“s”形，有明顯的

9、滯留期、指數(shù)生長(zhǎng)期、平臺(tái)期。隨著滲透壓的降低，細(xì)胞滯留期變短，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期提前，較早進(jìn)入平臺(tái)期。 3.通過(guò)對(duì)低滲壓作用后的MG63的ALP，以及胞內(nèi)鈣離子濃度(Ca<'2+>);變化分析發(fā)現(xiàn)，低滲處理組中，277mOsm、240mOsm和163mOsm組早期ALP活性降低，以后隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)，有所增加，但是仍然低于對(duì)照組。三個(gè)低滲處理組中各時(shí)間組的(Ca<'2+>)i均高于對(duì)照組(P<0.05)，且隨著作用時(shí)間延長(zhǎng)也是呈現(xiàn)增高趨

10、勢(shì)，分別在24h、12h和8h達(dá)到峰值，以后逐漸回落，但是仍然明顯高于對(duì)照組。 4.通過(guò)對(duì)PTH藥物動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的觀測(cè)期內(nèi)(24h)，PTH的免疫活性沒(méi)有明顯降低。說(shuō)明實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的觀測(cè)期合理，排除了實(shí)驗(yàn)結(jié)果是由于激素代謝導(dǎo)致藥效降低引起的誤差。 5.PTH對(duì)成骨樣細(xì)胞MG63的礦化影響具有時(shí)間依賴性，與藥物濃度關(guān)系不大。 6.間斷使用PTH和牽張力具有刺激成骨樣細(xì)胞MG63增殖分化的作用；小劑量、間斷

11、PTH刺激應(yīng)力狀態(tài)下的成骨樣細(xì)胞6h，PTHrPmRNA高表達(dá)，OCmRNA表達(dá)受到抑制。刺激3h則PTHrPmRNA的表達(dá)降低，而OCmRNA表達(dá)輕度升高；作用1h則PTHrPmRNA和OCmRNA的表達(dá)與對(duì)照組沒(méi)有明顯差異；相反PTH連續(xù)作用24h時(shí)，PTHrPmRNA和OCmRNA的表達(dá)均明顯降低。 7.間斷低濃度使用hPTH1-34，有助于應(yīng)力載荷后的成骨增殖活力的恢復(fù)，緩解過(guò)載荷狀態(tài)下成骨細(xì)胞的增殖抑制，利于基質(zhì)骨礦化

12、的形成；且加強(qiáng)地塞米松的成骨誘導(dǎo)作用。 結(jié)論： 1.低滲透液作為一種應(yīng)用于研究細(xì)胞離子通道的加力方式，同樣可以適用于研究細(xì)胞體外受力的生物學(xué)特性。其隨著滲透壓的逐漸降低，對(duì)成骨樣細(xì)胞所產(chǎn)生的作用效果，與以往采用四點(diǎn)彎曲等加載方式有著一定的相似作用趨勢(shì)。 2.采用低滲透液進(jìn)行細(xì)胞體外受力研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下(270-240mOsm，作用4—6小時(shí))，對(duì)成骨樣細(xì)胞MG63具有促進(jìn)增殖分化的作用，過(guò)強(qiáng)(163mOsm

13、，作用4—6小時(shí))、過(guò)小(270mOsm，作用0.5—2小時(shí))的應(yīng)力都不利于該細(xì)胞成熟分化。 3.對(duì)閾上刺激后的MG63，采用小劑量(20ng/ml)hPTH1-34的間斷誘導(dǎo)，具有調(diào)節(jié)PTHrPmRNA和OCmRNA的表達(dá)的作用。其中對(duì)閾上刺激后4h，PTH間斷作用6h，細(xì)胞的PTHrPmRNA的表達(dá)明顯增高，OCmRNA的表達(dá)則受到一定的抑制作用。結(jié)合胞內(nèi)游離鈣濃度的變化，說(shuō)明兩種基因表達(dá)的變化可能與胞內(nèi)鈣離子通道有關(guān)。同時(shí)