植物雌激素大豆苷元對人骨肉瘤MG63細(xì)胞凋亡、分化和生物學(xué)性狀的影響.pdf

1、研究背景:
　　骨肉瘤(osteosarcoma)是骨組織中最常見的一種惡性程度高的骨腫瘤，其發(fā)生很可能起源于成骨細(xì)胞終末分化以及骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的過程中。骨肉瘤細(xì)胞具有顯著的早期遷移能力與局部侵襲性，而這一特性也成為了骨肉瘤患者晚期致死的主要原因。因此深入研究骨肉瘤細(xì)胞的凋亡、分化及侵襲遷移等過程的信號通路，并尋找可以有效的逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的分子靶點(diǎn)，可為骨肉瘤治療及腫瘤轉(zhuǎn)移抑制提供有價值的理論和實驗依據(jù)。研究表

2、明，配體依賴轉(zhuǎn)錄因子核激素受體超家族的成員過氧化物酶體增殖活化受體(peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR)γ對多種腫瘤細(xì)胞凋亡和分化起著重要調(diào)控作用。近年來研究顯示，植物雌激素具有預(yù)防和抑制多種腫瘤，如乳腺癌、前列腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌、結(jié)腸癌等的作用。作為PPARγ激動劑配體的植物雌激素成員之一的大豆苷元(daidzein，DAI)，是一種從日常豆類食品中提取出來的黃酮類化

3、合物，其藥理作用豐富，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡、分化，且可抑制腫瘤遷移及癌組織血管生成的相關(guān)基因，但其機(jī)制目前尚未完全闡明。因此，探討DAI對人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡、分化及生物學(xué)性狀的影響，揭示其作用機(jī)制，將為骨肉瘤的臨床治療提供新的思路和策略。
　　研究目的:
　　本研究選擇人骨肉瘤細(xì)胞MG63為實驗對象，探討不同濃度的植物雌激素DAI對MG63細(xì)胞增殖活力、凋亡及細(xì)胞侵襲、遷移等生物學(xué)性狀的影響;同時觀察低濃度的DAI對MG63

4、細(xì)胞誘導(dǎo)分化的作用及其可能的分子機(jī)制。以期對惡性腫瘤的治療找到更適合的毒性更小的方法和策略，為臨床治療提供更多實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1.采用噻唑藍(lán)(MTT）比色法檢測濃度為0μM、1μM、10μM、20μM、40μM、80μM和160μM的DAI在不同時間內(nèi)對MG63細(xì)胞增殖的影響。
　　2.AV-FITC/PI雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測濃度為0μM、20μM和80μM的DAI作用24h和48h，細(xì)胞早期凋亡情況。

5、
　　3.Tunel法檢測DAI對MG63細(xì)胞凋亡的影響。
　　4.實時熒光定量PCR(Q-PCR)檢測濃度為0μM、20μM、40μM和80μM的DAI干預(yù)后，細(xì)胞凋亡與分化等相關(guān)基因表達(dá)量的變化。
　　5.磷酸苯二鈉法測定不同濃度的DAI干預(yù)后，細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(aIKalinephosphatase，ALP)表達(dá)活性的改變。
　　6.微量酶聯(lián)免疫法(ELISA)檢測不同濃度的DAI干預(yù)后，Ⅰ型膠原含量的變化

6、。
　　7.茜素紅染色法觀察不同濃度DAI干預(yù)后，MG63細(xì)胞內(nèi)鈣鹽沉積的情況。
　　8.劃痕實驗觀察濃度為0μM、20μM、40μM和80μM的DAI對MG63細(xì)胞遷移的影響。
　　9.Tramwell侵襲實驗觀察濃度為0μM、20μM、40μM和80μM的DAI對MG63細(xì)胞侵襲能力的影響。
　　10.免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)（immunocytochemistry，SP）檢測0μM、20μM、40μM和80μM的D

7、AI干預(yù)后MG63細(xì)胞侵襲遷移及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化。
　　結(jié)果:
　　1)MTT檢測結(jié)果顯示:DAI可以抑制細(xì)胞的增殖活力，且隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制作用增強(qiáng)，各組間比較其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2) AV-FITC/PI雙熒光標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:不同濃度的DAI分別干預(yù)MG63細(xì)胞24h和48h后，干預(yù)組的凋亡率較對照組均升高(P＜0.01)，其中80μM組的凋亡率明顯高于

8、20μM及對照組;80μM濃度時，48h凋亡率顯著高于24h。
　　3) Tunel檢測結(jié)果顯示:DAI干預(yù)MG63細(xì)胞后，各干預(yù)組細(xì)胞凋亡陽性染色結(jié)果均高于對照組(P＜0.01)，且陽性率與DAI濃度呈正相關(guān)。
　　4) qPCR檢測結(jié)果顯示:各濃度組DAI干預(yù)MG63細(xì)胞48h后，PPARγ表達(dá)量較對照組均升高(P＜0.01)，且隨干預(yù)濃度增加而增強(qiáng)，而Runx2的表達(dá)含量較對照組降低(P＜0.01)。
　　5)堿

9、性磷酸酶（ALP）檢測結(jié)果顯示:10μM、20μM和40μM低濃度的DAI作用于細(xì)胞6d、9d和12d后，三個時間點(diǎn)檢測ALP活性較對照組均升高，且在DAI作用的濃度區(qū)間內(nèi)ALP活性與干預(yù)細(xì)胞的DAI濃度呈正相關(guān)，在9d其活性到達(dá)峰值(P＜0.01)。
　　6)Ⅰ型膠原蛋白檢測結(jié)果顯示:10μM、20μM和40μM低濃度的DAI作用的MG63細(xì)胞Ⅰ型膠原的相對表達(dá)含量均高于對照組（P＜0.01），經(jīng)同一時間點(diǎn)組間兩兩比較，除了1d

10、和24d的20μ M與40μ M組無顯著差異外其它各組間均有差異(P＜0.05)。Ⅰ型膠原的相對含量可隨DAI作用時間延長而有所升高。
　　7)茜素紅染色檢測顯示:10μM、20μM及40μM低濃度的DAI干預(yù)MG63細(xì)胞20d后，加藥組MG63細(xì)胞較對照組鈣鹽沉積所導(dǎo)致的礦化結(jié)節(jié)的形成量明顯升高。
　　8)細(xì)胞劃痕實驗檢測結(jié)果顯示:DAI干預(yù)MG63細(xì)胞12h、24h及36h后細(xì)胞遷移能力較對照組均有所下降，且隨藥物濃度增

11、大，遷移抑制作用增強(qiáng)，80μM濃度組作用最強(qiáng)。
　　9) Transwell侵襲實驗檢測結(jié)果顯示:DAI干預(yù)后，MG63細(xì)胞的侵襲細(xì)胞數(shù)較對照組明顯減少，且DAI濃度越高發(fā)生侵襲的細(xì)胞數(shù)越少(P＜0.01)。
　　10)免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果顯示:DAI干預(yù)后的MG63細(xì)胞中的抑癌基因PTEN蛋白的表達(dá)量較對照組升高，而凋亡抑制蛋白Survivin和金屬基質(zhì)蛋白MMP-9的表達(dá)均較對照組減少(P＜0.01)。
　　結(jié)論:

12、
　　1.植物雌激素DAI能有效的抑制人骨肉瘤細(xì)胞MG63的增殖并能誘導(dǎo)其凋亡，且呈濃度、時間依賴性，其中80μM濃度組作用明顯。
　　2.DAI可上調(diào)PPARγ表達(dá)，下調(diào)凋亡抑制蛋白Survivin的表達(dá)，上調(diào)抑癌基因PTEN的表達(dá)，抑制成骨轉(zhuǎn)錄因子Runx2的轉(zhuǎn)錄活性，下調(diào)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的ECM重塑相關(guān)基因蛋白——金屬基質(zhì)蛋白（MMP-9）的表達(dá)，抑制MG63細(xì)胞侵襲和遷移。
　　3.低濃度DAI可使MG63細(xì)胞成骨