siRNA沉默Cdc2的表達(dá)對(duì)骨肉瘤MG63增殖及凋亡的影響.pdf

1、目的: Cdc2基因所編碼的蛋白是一種重要的細(xì)胞周期蛋白,在包括骨肉瘤MG63細(xì)胞的大多數(shù)腫瘤細(xì)胞中呈高表達(dá)。在本研究中采用siRNA干擾技術(shù),抑制骨肉瘤MG63細(xì)胞中Cdc2基因的表達(dá),觀察Cdc2基因表達(dá)抑制后對(duì)MG63細(xì)胞增殖及凋亡的影響。
　　方法:構(gòu)建針對(duì)Cdc2基因表達(dá)的特異性siRNA表達(dá)質(zhì)粒psilencer2.1-U6/Cdc2及對(duì)照psilencer2.1-U6/scramble質(zhì)粒,通過(guò)脂質(zhì)體介導(dǎo)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染入人

2、骨肉瘤MG63細(xì)胞株,通過(guò)Western blotting和定量PCR檢測(cè)MG63細(xì)胞中Cdc2在蛋白和mRNA水平的表達(dá)情況,免疫熒光進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)變化和Cdc2表達(dá)的情況,MTT法和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)psilencer2.1-U6/Cdc2對(duì)MG63細(xì)胞增殖能力和細(xì)胞周期的影響,Western blotting檢測(cè)細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-2,Bax的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:(1)經(jīng)重組質(zhì)粒DNA經(jīng)測(cè)序鑒定,成功構(gòu)建了pSilence

3、r2.1/SiRNA重組質(zhì)粒(2)將所構(gòu)建的pSilencer2.1/SiRNA重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染骨肉瘤MG63細(xì)胞, hygromycin篩選陽(yáng)性細(xì)胞克隆,經(jīng)Western blotting和RT-PCR法檢測(cè)結(jié)果表明,成功獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染psilencer2.1-U6/Cdc2質(zhì)粒的MG63細(xì)胞(MG63-SiRNA/Cdc2),和陰性對(duì)照細(xì)胞(MG63-SiRNA/Scramble),并通過(guò)灰度分析發(fā)現(xiàn),MG63-SiRNA/Cdc2細(xì)

4、胞中Cdc2mRNA和蛋白表達(dá)與MG63-SiRNA/Scramble細(xì)胞相比沉默效率分別為86％和89％。(3)MTT法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)干擾Cdc2的表達(dá)可以抑制MG63細(xì)胞的增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞主要易聚積于G2/M期, G0/G1期,同時(shí)S期細(xì)胞減少。Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn),干擾Cdc2基因的表達(dá)對(duì)MG63細(xì)胞中的凋亡蛋白Bcl-2,Bax的表達(dá)影響不大。
　　結(jié)論: Cdc2基因可能參與了腫瘤的發(fā)生過(guò)程,并與腫