不同力學(xué)因素作用下人源MG-63成骨樣細(xì)胞差異基因表達(dá)的研究.pdf

1、成骨細(xì)胞是骨形成細(xì)胞，在新骨形成和舊骨吸收的穩(wěn)態(tài)平衡中具有十分重要的意義。適當(dāng)應(yīng)力刺激作用于成骨細(xì)胞后可通過多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路傳導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部，促使成骨細(xì)胞分泌多種生長因子、轉(zhuǎn)錄因子，從而影響成骨細(xì)胞生物學(xué)功能。目前已證實，流體剪切應(yīng)力是成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞在生理狀態(tài)下感受到的主要機械應(yīng)力刺激。此外，重力作為一種場力，也可影響成骨細(xì)胞的功能。在航天飛行中的失重環(huán)境可導(dǎo)致航天員出現(xiàn)骨質(zhì)丟失，主要原因就是失重所導(dǎo)致的成骨細(xì)胞功能下降，骨形成能力降低

2、。目前，應(yīng)力和重力刺激對成骨細(xì)胞生物學(xué)功能影響的研究多集中在某個或者某些已知與成骨細(xì)胞功能密切相關(guān)的分子物質(zhì)，但基因水平的變化機制尚不明確。基因芯片技術(shù)將探針分子密集固定于支持物表面后與預(yù)先標(biāo)記熒光染料的樣品（蛋白質(zhì)、cDNA等）進(jìn)行雜交，通過測量探針的熒光強度從而獲得樣品的表達(dá)情況和序列信息。因此，利用基因芯片研究應(yīng)力和重力等力學(xué)因素調(diào)控成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的分子類型，對探索失重性骨質(zhì)丟失的細(xì)胞生物學(xué)機制，尋找對抗失重性骨質(zhì)丟失的分子靶

3、點，開發(fā)新型對抗措施具有重要意義。
　　本課題針對流體剪切應(yīng)力和重力兩種力學(xué)因素作用下成骨細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化開展研究工作。通過基因芯片技術(shù)，分別檢測了流體剪切應(yīng)力作用后人源MG-63成骨樣細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，回轉(zhuǎn)器模擬失重后MG-63細(xì)胞基因表達(dá)譜的變化，并選擇在兩種應(yīng)力變化下均顯著差異表達(dá)的基因ESM1，進(jìn)一步探討了ESM1對成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。具體實驗結(jié)果如下：
　　一、流體剪切應(yīng)力作用后MG-63細(xì)胞差異基因

4、研究
　　MG-63細(xì)胞以適當(dāng)密度（1×105個/孔）接種于載玻片（25.5×21.5mm），于六孔板中常規(guī)培養(yǎng)72h。將細(xì)胞隨機分為剪切應(yīng)力組和正常對照組。剪切應(yīng)力組移至流體剪切系統(tǒng)中給予符合在體生理范圍的流體剪切應(yīng)力刺激（1.5 Pa,60min）。正常對照組細(xì)胞給予除流體剪切應(yīng)力作用外的相同處理。處理結(jié)束后分別提取兩組總RNA，對RNA進(jìn)行質(zhì)檢，合格后進(jìn)行Affymetrix基因芯片雜交掃描，并對芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

5、
　　經(jīng)過芯片掃描，發(fā)現(xiàn)剪切應(yīng)力組與正常對照組相比，有6223個基因發(fā)生了改變，其中表達(dá)上調(diào)基因2554個，表達(dá)下調(diào)基因3669個。Gene ontology注釋分析發(fā)現(xiàn)，差異基因主要參與細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)響應(yīng)、細(xì)胞凋亡調(diào)控和細(xì)胞增殖等功能調(diào)控。Pathway富集注釋分析還發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因主要參與了 MAPK信號通路、TGF-β信號通路、P53信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、Focal adhesion信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和Wnt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的

6、信號調(diào)控。在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)變化倍數(shù)最大的各10個差異基因中，15個基因尚未見在成骨細(xì)胞中開展過研究報道。
　　二、模擬失重后MG-63細(xì)胞差異基因研究
　　MG-63細(xì)胞以適當(dāng)密度（1×105個/孔）接種于載玻片（25.5×21.5mm），于六孔板中常規(guī)培養(yǎng)72h。將細(xì)胞隨機分為模擬失重組和正常對照組。模擬失重組置于2D-RWVs型雙向多樣本回轉(zhuǎn)器中回轉(zhuǎn)，回轉(zhuǎn)速度24rpm，作用時間48h。正常對照組細(xì)胞在回轉(zhuǎn)艙中靜置相同時

7、間。處理結(jié)束后分別提取兩組的總RNA，質(zhì)檢合格后進(jìn)行Affymetrix基因芯片雜交掃描，并對芯片結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析。
　　基因芯片掃描結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模擬失重組與正常對照組相比，197個基因發(fā)生了改變，其中表達(dá)上調(diào)基因151個，表達(dá)下調(diào)基因46個。Gene ontology注釋分析發(fā)現(xiàn)，表達(dá)上調(diào)基因主要參與細(xì)胞生物合成進(jìn)程的負(fù)性調(diào)控和細(xì)胞死亡的調(diào)控等功能調(diào)控。表達(dá)下調(diào)基因主要參與細(xì)胞骨架聯(lián)接、細(xì)胞大分子物質(zhì)代謝等細(xì)胞組分和功能調(diào)控

8、。差異表達(dá)基因翻譯蛋白相互作用分析發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OS、FOSB、STAT3和HBEGF等差異表達(dá)基因的蛋白產(chǎn)物與其他差異表達(dá)基因蛋白產(chǎn)物相互作用關(guān)系緊密。在上調(diào)和下調(diào)表達(dá)變化倍數(shù)最大的各10個差異基因中，13個基因尚未見在成骨細(xì)胞中開展過研究報道。
　　三、模擬失重后差異表達(dá)基因ESM1對成骨細(xì)胞生物學(xué)功能的影響
　　流體剪切應(yīng)力和模擬失重后的基因芯片結(jié)果中，均顯示ESM1發(fā)生顯著性差異性表達(dá)。為此，我們對ESM1在成骨細(xì)胞生物學(xué)

9、功能中的作用進(jìn)行了驗證性研究。首先，使用實時熒光定量PCR技術(shù)驗證回轉(zhuǎn)器模擬失重后MG-63細(xì)胞中ESM1基因的表達(dá)變化；其次，通過轉(zhuǎn)染siRNA抑制ESM1基因表達(dá)，觀察MG-63細(xì)胞增殖、分化、礦化能力的變化。
　　結(jié)果證實，在模擬失重后ESM1的基因表達(dá)顯著上調(diào)。通過轉(zhuǎn)染siRNA沉默ESM1表達(dá)后，MG-63細(xì)胞增殖能力顯著增強，表明ESM1對MG-63細(xì)胞的增殖有負(fù)性調(diào)控作用；抑制ESM1表達(dá)后，MG-63細(xì)胞分化標(biāo)志物

10、ALP、RUNX2表達(dá)量顯著下降，表明ESM1對MG-63細(xì)胞的分化有正性調(diào)控作用；抑制ESM1表達(dá)后，茜素紅染色表明細(xì)胞礦化能力顯著增強，表明ESM1對MG-63細(xì)胞的礦化有負(fù)性調(diào)控作用。
　　綜上所述，流體剪切應(yīng)力和模擬失重作用后人源MG-63成骨樣細(xì)胞的基因表達(dá)譜發(fā)生了顯著改變。差異表達(dá)基因廣泛參與細(xì)胞的分子功能、細(xì)胞組分、生物學(xué)途徑和信號通路調(diào)控。同時，在高倍數(shù)差異表達(dá)的基因中，較多基因在成骨細(xì)胞功能調(diào)控中的作用尚不明確。