植物雌激素葛根素、大豆苷元對(duì)人成骨樣細(xì)胞MG-63的作用及相關(guān)分子機(jī)制的研究.pdf

1、目的：研究已證實(shí)異黃酮類化合物葛根素(puerarin)和大豆苷元(daidzein)對(duì)去卵巢大鼠具有明顯的抗骨質(zhì)疏松活性，并能夠顯著促進(jìn)原代培養(yǎng)的大鼠成骨細(xì)胞增殖和分化。本室前期工作已證實(shí)葛根素能劑量依賴性促進(jìn)大鼠成骨樣細(xì)胞增殖，抑制體外破骨細(xì)胞性骨吸收功能并在體外促進(jìn)小鼠長(zhǎng)骨生長(zhǎng)，但有關(guān)兩種植物雌激素對(duì)人成骨細(xì)胞作用及作用機(jī)制的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本工作在文獻(xiàn)報(bào)道和前期研究的基礎(chǔ)上，以人成骨樣細(xì)胞MG-63為研究模型，觀察了葛根素和大豆

2、苷元對(duì)人成骨細(xì)胞增殖、分化、存活、骨吸收調(diào)節(jié)因子如骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)/NF-κB激活受體配體(receptor activator of NF-κ13 ligand，RANKL)/NF-κB激活受體(receptor activator of NF-κB，RANK)系統(tǒng)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及其受體表達(dá)的作用，并對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了初步探討。
　　 方法：

3、　　 1.MTT法觀察葛根素和大豆苷元對(duì)人成骨樣細(xì)胞MG-63細(xì)胞的增殖能力的影響。
　　 2.引用流式細(xì)胞術(shù)分析葛根素和大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響。
　　 3.磷酸苯二鈉法檢測(cè)堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性。
　　 4.DAPI染色法觀察葛根素和大豆苷元對(duì)順鉑誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡能力的影響。
　　 5.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcri

4、ption polymerase chain reaction，RT-PCR)檢測(cè)OPG、RANKL、IL-6及其受體（IL-6Rα、gp130）、ERα、ERβ、凋亡抑制蛋白Bcl-xL和X染色體連鎖的凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP) mRNA的表達(dá)水平。
　　 6.酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（enzyme-linked immnosorbent assay，ELI

5、SA）法檢測(cè)IL-6蛋白的表達(dá)水平和I型膠原酶的含量。
　　 7.免疫印跡( Western Blot)技術(shù)檢測(cè)OPG、RANKL、IL-6Rα、gp130、ERα和ERβ蛋白的表達(dá)水平。
　　 8.應(yīng)用雌激素受體(estrogen receptor, ER)阻斷劑ICI182，780觀察ER在葛根素和大豆苷元調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞上述生物學(xué)性能中的作用。
　　 9.采用RNA干擾技術(shù)(RNA interference，R

6、NAi)分別對(duì)MG-63細(xì)胞的雌激素受體(estrogen receptor，ER)α和ERβ基因進(jìn)行沉默，G418篩選出陽(yáng)性單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)后用Western Blot技術(shù)分別鑒定出ERα或ERβ高、中抑制表達(dá)克隆用于確定ER亞型在介導(dǎo)兩種植物雌激素調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞上述生物學(xué)性能中的作用。
　　 10.應(yīng)用Western Blot技術(shù)及特異性信號(hào)阻斷劑PD98059(MEK1/2阻斷劑)和Wortmannin(PI3K阻斷劑)分析

7、兩種植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞發(fā)揮作用的相關(guān)信號(hào)通路。
　　 結(jié)果：
　　 1.葛根素和大豆苷元均可顯著促進(jìn)人成骨樣MG-63細(xì)胞增殖，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩種植物雌激素可使G1期細(xì)胞比例減少，G2+S期細(xì)胞比例增加。
　　 2.葛根素和大豆苷元可通過(guò)增加MG-63細(xì)胞中ALP活性和Ⅰ型膠原含量促進(jìn)成骨細(xì)胞分化成熟。
　　 3.葛根素和大豆苷元均可顯著抑制由順鉑誘導(dǎo)的MG-63細(xì)胞發(fā)生凋亡，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)兩種植物雌激

8、素可上調(diào)MG-63細(xì)胞中XIAP和Bcl-xL的mRNA表達(dá)。
　　 4.葛根素和大豆苷元均顯著上調(diào)MG-63細(xì)胞中OPG的mRNA及蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)RANKL的mRNA及蛋白水平。
　　 5.ER阻斷劑ICI182，780可部分阻斷葛根素和大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞的上述作用，其中葛根素對(duì)MG-63細(xì)胞的增殖和分化是由ERα和ERβ共同介導(dǎo)；大豆苷元對(duì)MG-63細(xì)胞的增殖是主要由ERα介導(dǎo)，其分化是由ERα和ERβ共同

9、介導(dǎo)；兩種植物雌激素對(duì)MG-63細(xì)胞IL-6產(chǎn)生主要是由ERα介導(dǎo)。
　　 6.葛根素和大豆苷元均能上調(diào)成骨細(xì)胞中ERα和ERβ的mRNA和蛋白表達(dá)水平；大豆苷元對(duì)成骨細(xì)胞中兩種ER亞型表達(dá)水平的作用強(qiáng)于葛根素。
　　 7.葛根素能上調(diào)MG-63細(xì)胞中ERK和Akt的磷酸化表達(dá)水平；大豆苷元僅上調(diào)MG-63細(xì)胞中ERK的磷酸化水平，對(duì)成骨細(xì)胞中Akt的磷酸化表達(dá)水平作用不明顯。
　　 8.PD98059明顯阻斷葛

10、根素和大豆苷元誘導(dǎo)的促成骨細(xì)胞增殖和分化作用；Wortmannin僅能阻斷葛根素誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞上述作用，對(duì)大豆苷元作用不明顯。
　　 9.Wortmannin可明顯阻斷兩種植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞中IL-6的作用，PD98059對(duì)兩種植物雌激素誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的上述作用效果不明顯。
　　 結(jié)論：
　　 1.葛根素、大豆苷元對(duì)人成骨細(xì)胞的增殖、分化及OPG表達(dá)有明顯的促進(jìn)作用，對(duì)RANKL和IL-6表達(dá)則有一定的抑制作用，

11、此外兩種植物雌激素還具有抗成骨細(xì)胞凋亡的功能。
　　 2.葛根素和大豆苷元均可部分經(jīng)由ER途徑對(duì)成骨細(xì)胞發(fā)揮上述作用，其中葛根素對(duì)成骨細(xì)胞的增殖和分化是由ERα和ERβ共同介導(dǎo)；大豆苷元對(duì)成骨細(xì)胞的增殖是主要由ERα介導(dǎo)，其分化是由ERα,和ERβ共同介導(dǎo)；兩種植物雌激素對(duì)成骨細(xì)胞IL-6產(chǎn)生主要是由ERα介導(dǎo)。此外，兩種植物雌激素均能上調(diào)成骨細(xì)胞中ERα和ERβ的表達(dá)水平，其中大豆苷元的作用強(qiáng)于葛根素。
　　 3.葛根