恒定磁場(chǎng)對(duì)大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞成骨的影響及作用MG63細(xì)胞驗(yàn)證無(wú)鎳不銹鋼生物相容性的研究.pdf

1、目的：實(shí)驗(yàn)第一部分:首先利用稀土磁鐵釹鐵硼在實(shí)驗(yàn)室條件下構(gòu)建一個(gè)恒定磁場(chǎng),采用全骨髓培養(yǎng)法分離培養(yǎng)大鼠的骨髓來(lái)源基質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)表面標(biāo)志檢測(cè)后,傳代擴(kuò)增,將一部分基質(zhì)干細(xì)胞接種于直徑3.5cm培養(yǎng)皿中,然后將接種了基質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)皿分為兩組,第一組采用藥物來(lái)誘導(dǎo)基質(zhì)干細(xì)胞成骨的方法,即使用成骨條件培養(yǎng)基(含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入0.1uM的地塞米松,10Mmβ-磷酸甘油鈉,0.2mM的維生素C)。將大鼠的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成

2、骨細(xì)胞誘導(dǎo)。另外一組首先加入與第一組相同的藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基,之后將培養(yǎng)皿放在細(xì)胞培養(yǎng)箱的稀土磁鐵釹鐵硼上,每天放置12小時(shí)使其在恒定磁場(chǎng)下暴磁,之后將其放入另外的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩組細(xì)胞分別連續(xù)培養(yǎng)7天,在1、3、5、7天分別取出兩組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)光鏡觀察,用MTr法進(jìn)行細(xì)胞增值檢測(cè),堿性磷酸酶表達(dá)水平檢測(cè),細(xì)胞VonKossa染色,第七天進(jìn)行細(xì)胞爬片的掃描電鏡觀察。比較兩組細(xì)胞成骨能力的不同,進(jìn)而評(píng)價(jià)恒定磁場(chǎng)在大鼠基質(zhì)干細(xì)胞體外

3、成骨誘導(dǎo)中的作用。同時(shí),將另外一部分基質(zhì)干細(xì)胞接種與金屬鈦表面,將接種了基質(zhì)干細(xì)胞的鈦片放入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中,同樣分為兩組,一組加入藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基,另外一組在加入藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基的同時(shí)按照同樣方法進(jìn)行周期性的磁場(chǎng)刺激。在接種基質(zhì)干細(xì)胞24h后,檢測(cè)兩組鈦片表面的細(xì)胞粘附率,在連續(xù)培養(yǎng)7天后,對(duì)兩組鈦片表面進(jìn)行堿性磷酸酶染色和掃描電鏡觀察,比較兩組細(xì)胞成骨趨勢(shì)的不同,進(jìn)而評(píng)價(jià)恒定磁場(chǎng)對(duì)于鈦表面生長(zhǎng)的基質(zhì)干細(xì)胞的成骨作用的影響

4、。實(shí)驗(yàn)的第二部分是使用MG63細(xì)胞系來(lái)檢測(cè)新型生物材料無(wú)鎳不銹鋼的生物相容性。首先培養(yǎng)擴(kuò)增MG63細(xì)胞,之后將MG63細(xì)胞分別接種于無(wú)鎳不銹鋼,317L,CoCrMo合金的表面,置于6孔板中,培養(yǎng)基為含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,在開(kāi)始培養(yǎng)12小時(shí)后檢測(cè)三種金屬表面的細(xì)胞粘附率,在培養(yǎng)的1,3,5天進(jìn)行MTT檢測(cè),堿性磷酸酶檢測(cè),金相顯微鏡觀察,比較三中金屬生物相容性的不同。
　　 方法：實(shí)驗(yàn)一所需要的恒定磁場(chǎng)由稀土磁鐵釹鐵

5、硼產(chǎn)生,首先與中國(guó)科學(xué)院金屬研究所合作測(cè)定實(shí)驗(yàn)所用的稀土磁鐵釹鐵硼的磁場(chǎng)強(qiáng)度,將稀土磁鐵釹鐵硼用75％的乙醇浸泡20min.風(fēng)干后于紫外線照射30min.保持無(wú)菌狀態(tài)移入細(xì)胞培養(yǎng)箱,過(guò)夜后備用。由中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的四周齡SD大鼠(雌雄不限),脫頸處死后浸泡于75％的酒精中30min。無(wú)菌取出大鼠的雙側(cè)股骨,盡量去除軟組織,用無(wú)菌剪刀剪除兩端,用含10％胎牛血清的DMEM沖洗骨髓腔,所得的液體經(jīng)過(guò)200目篩網(wǎng),收集液體接種于2

6、5cm2培養(yǎng)瓶中,放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中,5％CO2、37℃,24小時(shí)后換液,首次換液禁用PBS緩沖液洗滌細(xì)胞,輕輕倒出原培養(yǎng)基,小心注入新鮮培養(yǎng)基。倒置顯微鏡觀察,當(dāng)細(xì)胞接近與75％相互接觸時(shí),進(jìn)行細(xì)胞傳代。一般4-5天傳代,傳代比例為1:3,取前兩代細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞表面抗原檢測(cè),對(duì)基質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定。當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增到所需數(shù)量時(shí),即可著手準(zhǔn)備對(duì)細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)和相關(guān)檢測(cè)了。首先將培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基倒掉,PBS緩沖液洗滌細(xì)胞,加入2.5％的胰蛋白酶5ml消

7、化5min(此過(guò)程在光鏡監(jiān)視下完成),輕輕倒掉胰蛋白酶,加入2ml培養(yǎng)基反復(fù)吹打,收集液體于離心管中,1000r/min離心5min.棄去上清,2ml培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,細(xì)胞計(jì)數(shù)板細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為4×104/ml,接種于3.5cm培養(yǎng)皿2ml。1天后換液,3天后再次換液,5天后光鏡下檢查培養(yǎng)皿,選擇細(xì)胞生長(zhǎng)均勻,形態(tài)良好,無(wú)大片空白區(qū)或重疊生長(zhǎng)的培養(yǎng)皿為本實(shí)驗(yàn)選材。將經(jīng)過(guò)篩選的培養(yǎng)皿隨機(jī)分為兩組,,第一組采用藥物的基質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)成骨

8、方法,即在含10％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中加入0.1uM的地塞米松,10mMβ-磷酸甘油鈉,0.2mM的維生素C.將大鼠的基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)。另外一組首先加入與第一組相同的藥物誘導(dǎo)成骨培養(yǎng)基,之后將培養(yǎng)皿放在細(xì)胞培養(yǎng)箱的稀土磁鐵釹鐵硼上,每天放置12小時(shí),之后將其放入另外的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。兩組細(xì)胞分別培養(yǎng)7天,在1、3、5、7天分別取出兩組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)光鏡觀察并且照相,在相同的時(shí)間點(diǎn)上,將兩組細(xì)胞濃度調(diào)整為1×104/

9、ml,并接種在96孔板中,每孔加20ul的MTT,置于37℃培養(yǎng)箱中孵育4小時(shí)取出,吸除培養(yǎng)基后每孔加150ul的二甲基亞砜10分鐘后充分震蕩,置酶標(biāo)儀上選擇490nm波長(zhǎng)測(cè)0D值。每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)五次。同樣在相同時(shí)間點(diǎn)上,從兩組中取出培養(yǎng)皿,用PBS輕輕沖洗3遍,在4℃環(huán)境下用0.01％TritonX-100裂解細(xì)胞12h,然后用吸管反復(fù)吹打1min,使細(xì)胞充分碎解。以14000r/min離心5min,吸取一部分上清液并用對(duì)一硝基苯磷酸鹽

10、(即PNPP)法檢測(cè)ALP(試劑盒),另一部分上清液用考馬斯亮蘭法測(cè)定總蛋白含量。堿性磷酸酶活性以每克蛋白中含有的金氏單位表示,結(jié)果以五次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值表示。對(duì)于VonKossa染色,將在測(cè)試時(shí)間點(diǎn)上的培養(yǎng)皿用含10％甲醛的PBS固定10min.之后用水清洗干凈,加入2％的硝酸銀溶液,在紫外線下孵育1h,之后用3％的硫代硫酸鈉中和5min,倒置顯微鏡下觀察照相。成骨能力旺盛的細(xì)胞會(huì)被銀原子染成黑色。在誘導(dǎo)的第7天,取出兩組中的蓋玻片進(jìn)

11、行掃描電鏡觀察。具體方法為:事先將無(wú)菌的蓋玻片放入培養(yǎng)皿中,將1.5ml的密度為1×104/ml的基質(zhì)干細(xì)胞滴在蓋玻片上,依靠表面張力使液體不外流。按照實(shí)驗(yàn)條件分為兩組。連續(xù)誘導(dǎo)7天,在第7天時(shí)取出蓋玻片,置于2.5VOL％戊二醛固定液于4℃度冰箱中固定(最短兩小時(shí))。吸去戊二醛固定液,加入蒸餾水清洗,隨后分別用50、75、95、100vol％的乙醇水溶液進(jìn)行系列脫水各十分鐘。將樣品取出后放入玻璃培養(yǎng)皿中。4℃冰箱中干燥12小時(shí)或過(guò)夜干

12、燥。采用掃描電子顯微鏡(SEM)對(duì)基質(zhì)干細(xì)胞的形態(tài)等進(jìn)行觀察和分析并比較。另外取大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,接種于直徑為1cm的金屬鈦片上,將鈦片置于直徑為3.5cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,將接種了基質(zhì)干細(xì)胞的鈦片隨機(jī)分為兩組,一組加入藥物誘導(dǎo)培養(yǎng)基,另外一組除加入藥物培養(yǎng)基外,同時(shí)按照以上的方法進(jìn)行磁場(chǎng)周期性刺激,兩組細(xì)胞連續(xù)培養(yǎng)7天,在最初的24小時(shí)后,分別取兩組鈦片進(jìn)行細(xì)胞粘附率檢測(cè),7天后分別對(duì)兩組細(xì)胞進(jìn)行堿性磷酸酶染色和掃描電鏡觀察,堿性磷酸

13、酶染色采用試劑盒法,隨機(jī)選取5個(gè)視野,計(jì)算染色細(xì)胞占總細(xì)胞的比例,計(jì)算比較。,掃描電鏡采用以上方法進(jìn)行樣本制備。比較兩組細(xì)胞形態(tài)的不同。實(shí)驗(yàn)的第二部分:關(guān)于無(wú)鎳不銹鋼的生物相容性的研究,采取以下方法:首先制備三種金屬的金屬片樣本,金屬片直徑為1cm厚度為1mm的圓形,超聲清潔消毒后備用,首先進(jìn)行MC63細(xì)胞的傳代擴(kuò)增。待細(xì)胞達(dá)到所需數(shù)量后,將細(xì)胞以4×104/ml接種與金屬片上,每個(gè)金屬片1ml,利用表面張力使液體不外流,在培養(yǎng)的第12

14、小時(shí),分別取出3組金屬片,用PBS輕輕沖洗表面,去除未貼壁細(xì)胞,加入0.25％的胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化下來(lái),收集后細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算12小時(shí)的細(xì)胞貼壁率,并且相互比較。在培養(yǎng)的1,3,5,天,分別取三組金屬片的細(xì)胞按照實(shí)驗(yàn)1的方法進(jìn)行MTT,堿性磷酸酶檢測(cè),并在金相纖維鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。以上實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用SPSS數(shù)據(jù)分析軟件,配對(duì)t檢驗(yàn),p＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 結(jié)果：實(shí)驗(yàn)一的結(jié)果為,在1天時(shí),兩組間的MTT檢測(cè),AL

15、P活性檢測(cè),VonKossa染色,無(wú)明顯區(qū)別,在第3天時(shí),ALP活性檢測(cè),VonKossa染色依然沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。而MTT檢測(cè)顯示細(xì)胞增值有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在5、7天時(shí),所有檢測(cè)均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。掃描電鏡在第7天顯示兩組細(xì)胞形態(tài)有明顯差異。在金屬鈦表面實(shí)驗(yàn)部分結(jié)果為在接種基質(zhì)干細(xì)胞24h后,兩組鈦表面的細(xì)胞粘附率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,磁場(chǎng)組的粘附率要高于非磁場(chǎng)組。在第七天時(shí),堿性磷酸酶染色結(jié)果顯示磁場(chǎng)組的陽(yáng)性率要高于非磁場(chǎng)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。掃描電

16、鏡可見(jiàn)磁場(chǎng)顯著改變了基質(zhì)干細(xì)胞的表面形態(tài),細(xì)胞被拉長(zhǎng)。實(shí)驗(yàn)二部分的結(jié)果為在12小時(shí),三組細(xì)胞的貼壁率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。關(guān)于堿性磷酸酶檢測(cè),在第一天時(shí),三種金屬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在第三天和第五天時(shí),無(wú)鎳不銹鋼的堿性磷酸酶的活性要高于另外兩種金屬。細(xì)胞的MTT檢測(cè)顯示在第一天時(shí),三種金屬無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在第三天和第五天時(shí),無(wú)鎳不銹鋼的細(xì)胞增值要高于另外兩種金屬。
　　 結(jié)論：0.2T的恒定磁場(chǎng)可以顯著增強(qiáng)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞在體外和金屬鈦表面向成骨