不同孔徑的磷酸鈣骨水泥對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞生物相容性影響差異的研究.pdf

1、背景：大段骨缺損的修復一直是臨床上所面臨的難題，骨組織工程的研究和發(fā)展為大段骨缺損的修復提供了一條良好的途徑，相關實驗研究報道利用支架材料復合生長因子以及種子細胞配合適宜的體內(nèi)力學環(huán)境可有效的修復大段骨缺損模型，但是不同結構、組成的支架材料植入體內(nèi)后新生骨組織長入速率存在很大的差異。研究表明，材料結構可以明顯影響骨組織的長入速度，而孔隙率和孔徑大小又是其中最為重要的影響因素。因此研究不同孔徑大小的支架材料對大段骨缺損的治療顯得尤為重要。

2、本研究采用三種孔徑大小(200-300μm、300-450μm、450-600μm)的磷酸鈣骨水泥材料與骨髓間充質(zhì)干細胞在體外共同培養(yǎng)的方法，觀察材料表面的細胞黏附、增殖和分化能力的差異，分析材料孔徑結構在促進骨折愈合機制中的作用。
　　實驗一CPC材料的孔徑大小與大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞黏附能力之間的關系
　　目的：評價不同大小孔徑的磷酸鈣骨水泥(Calciumphosphatecement,CPC)材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞

3、(Bonemesenchymalstemcells,BMSCs)黏附能力的影響。方法：用鹽析法制備三種不同孔徑的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料，利用Micro-CT測量三種材料的平均孔徑、孔隙率。無菌條件下取新生大鼠BMSCs原代培養(yǎng)并傳代；將三組材料分別放置于24孔板內(nèi)，每個材料接種2×105個細胞后，37℃、飽和濕度環(huán)境下靜置培養(yǎng)。于接種后第12h、24h收集細胞并計數(shù)，計算細胞黏附率；并在

4、第24h收集細胞行AnnexinVFITC/PI雙標記，流式細胞儀檢測細胞凋亡、壞死檢測，并利用掃描電鏡觀察細胞形態(tài)及黏附情況。結果：micro-CT測量結果顯示：三種CPC材料孔徑間相互連通，孔隙率均大于67％，平均孔徑分別為240μm、410μm、510μm。第12h，三種材料表面細胞黏附率及壞死率均無明顯差別(P＞0.05)；200-300μm組在第24h細胞黏附量明顯少于300-450μm組和450-600μm組，差值具有統(tǒng)計學

5、意義(P＜0.05)；200-300μm組材料表面細胞壞死數(shù)量明顯多于450-600μm組，(P＜0.05)。結論：孔徑大小可影響大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的黏附能力，隨著孔徑增大，細胞黏附率逐漸增高，細胞壞死率逐漸降低。本實驗為進一步研究孔徑結構對細胞的增殖、分化提供了實驗依據(jù)。
　　實驗二不同孔徑CPC材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖的影響
　　目的：評價不同大小孔徑的磷酸鈣骨水泥(Calciumphosphatec

6、ement,CPC)材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞增殖能力的影響。方法：將三種不同孔徑的(200-300μm、300-450μm、450-600μm)CPC材料分為三組，每個材料接種P3代大鼠間充質(zhì)干細胞5×104個細胞，37℃、飽和濕度環(huán)境下靜置培養(yǎng)。于接種后第1、4、7、14、21天用PICOGREEN細胞繁殖定量檢測試劑盒測定細胞增殖率，并在第14天、21天用戊二醛固定材料，梯度脫水、干燥噴金，利用掃描電鏡觀察材料表面細胞生長情況。結

7、果：細胞在三組材料上均呈對數(shù)增長趨勢，第14天左右即到達平臺期，在第1天三組細胞數(shù)量無明顯差異，第4天大孔徑(450-600μm)材料組細胞數(shù)量明顯高于其余兩組(P＜0.05)，在第7天細胞數(shù)量隨孔徑的增加依次增加，3組間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)，第14天和第21天200-300μm組細胞數(shù)量明顯少于其余兩組(300～450μm、450～600μm)(P＜0.05)，300-450μm組和450-600μm組間無統(tǒng)計學差異(P＞0

8、.05)。結論：材料孔徑結構可影響大鼠BMSCs在多孔CPC材料上的增殖能力，大孔徑材料較小孔徑材料更利于細胞增殖。為進一步研究孔徑結構對細胞的成骨分化提供了實驗依據(jù)。
　　實驗三不同孔徑CPC材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化的影響
　　目的：評價不同大小孔徑的磷酸鈣骨水泥(Calciumphosphatecement,CPC)材料對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化能力的影響。方法：將三種不同孔徑的(200-300μm、300

9、-450μm、450-600μm)CPC材料分為三組，每個材料接種P3代大鼠間充質(zhì)干細胞5×104個細胞，37℃、飽和濕度環(huán)境下靜置，成骨培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)。于接種后第47、14、21天用ALP活性測定試劑盒測定細胞ALP活性；并提取總RNA，qRT-PCR測定成骨相關基因的表達。結果：通過堿性磷酸酶活性測定以及qRT-PCR測定5對成骨基因顯示：在200-300μm孔徑CPC材料組表面細胞成骨分化程度明顯好于其余兩組(P＜0.05)。結論