異種骨支架與人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞相容性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:(1)研究脫脂、脫蛋白后豬松質(zhì)骨支架材料的生物學(xué)性能。(2)研究脊柱術(shù)中出血中的hBMSCs的細(xì)胞學(xué)特性。(3)探討不同方法改性的豬松質(zhì)骨支架材料的細(xì)胞相容性情況。
　　 方法:(1)通過超聲聯(lián)合化學(xué)方法對(duì)豬松質(zhì)骨支架材料進(jìn)行脫脂、脫蛋白去抗原處理。(2)大體觀察骨支架材料的形貌特征,組織切片HE染色觀察材料的組織學(xué)結(jié)構(gòu),比重法檢測(cè)支架材料的孔隙率,檢測(cè)支架材料的pH值及微生物生長(zhǎng)情況。(3)通過密度梯度離心法分離脊柱手術(shù)

2、出血中的hBMSCs;倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況,流式細(xì)胞儀分析第三代hBMSCs表面分子表達(dá)情況。對(duì)第三代hBMSCs細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng),在誘導(dǎo)后第3、7、14、21天檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性;在誘導(dǎo)培養(yǎng)第21天對(duì)礦化結(jié)節(jié)行茜素紅染色。(4)采用不同材料包被支架材料對(duì)支架材料改性,分為A、B、C三組,A組為胎牛血清包被,B組為Ⅰ型膠原蛋白包被,C組為對(duì)照組。每塊材料上加入濃度為1×109/ml的細(xì)胞懸液250μ l。分別在第6、12

3、、24、48小時(shí)采用胰蛋白酶消化細(xì)胞計(jì)數(shù),計(jì)算三組的細(xì)胞粘附率;在第3、6、9、12、14天采用MTT法觀察三組的細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果:(1)經(jīng)過處理的骨支架材料外觀呈白色,其表面具有多孔結(jié)構(gòu)微孔壁光滑,HE染色鏡下觀察到網(wǎng)狀骨小梁,骨小梁結(jié)構(gòu)完整,無(wú)破壞,骨髓腔中血細(xì)胞、脂肪細(xì)胞去除,亦未見基質(zhì)細(xì)胞殘留,橢圓形骨陷窩空虛,未見骨細(xì)胞核及其它結(jié)構(gòu)。骨支架材料浸泡液pH值第1-7天平均7.356±0.034,呈中性。比重法測(cè)

4、得骨支架材料的孔隙率高達(dá)81.34％±4.31％。在24、48、72小時(shí)三個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn),浸泡骨支架材料的完全培養(yǎng)基色澤清亮,無(wú)混濁及懸浮物,鏡下觀察,亦未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌及真菌生長(zhǎng)。(2)脊柱外科術(shù)中出血中分離出原代hBMSCs貼壁生長(zhǎng),呈梭形、多角形。流式細(xì)胞儀分析第三代hBMSCs高表達(dá)CD73、CD90、CD105,低表達(dá)CD14、CD19、CD34、CD45。hBMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)分化后,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),堿性磷酸酶活性增高。誘導(dǎo)分化培養(yǎng)

5、21天后茜素紅染色顯示成骨細(xì)胞體外礦化特性。(3)采用胰蛋白酶消化法計(jì)計(jì)算細(xì)胞粘附率,hBMSCs粘附率在不同方法處理的支架上細(xì)胞粘附時(shí)相變化的趨勢(shì)不同,比較結(jié)果細(xì)胞粘附率B組＞A組＞C組。采用MTT法檢測(cè)hBMSCs增殖情況,C組細(xì)胞增值情況較A、B兩組增值情況比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05);而第3、6、9、12、14天A、B兩組之間細(xì)胞增殖情況比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論:(1)經(jīng)脊柱術(shù)中出血分離的h