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文檔簡介
1、核因子-κB受體活化因子配體(receptoractivatorofNF-κBligand,RANKL)從屬于腫瘤壞死因子(tumornecrosisfactor,TNF)超家族,是一種表達(dá)于成骨細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等細(xì)胞表面的膜蛋白,對于T細(xì)胞、樹突細(xì)胞和破骨細(xì)胞的發(fā)育及功能具有重要的作用,其中破骨細(xì)胞的分化對于RANKL的表達(dá)呈現(xiàn)出絕對的依賴性。研究表明,骨保護(hù)素(osteoprotegerin,OPG)/RANKL/核因子
2、κB受體活化因子(receptoractivatorofNF-κB,RANK)信號通路為闡明骨代謝疾病的發(fā)生機(jī)制奠定了基礎(chǔ),OPG和RANK均通過與RANKL競爭性結(jié)合發(fā)揮生物效應(yīng),因此RANKL在該骨代謝軸中起樞紐作用。 TNF超家族的絕大多數(shù)成員可抑制細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,有研究顯示,RANKL抑制單核細(xì)胞RAW264.7的增殖,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,其機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因cyclinD1,cyclinD3,
3、cyclinE,上調(diào)cyclin依賴的激酶抑制劑p27有關(guān)。但RANKL對成骨細(xì)胞功能的影響及機(jī)制研究,國內(nèi)外均未見相關(guān)報道。 RNA干擾(RNAinterference,RNAi),又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(posttranscriptionalgenesilencing,PTGS),其最大潛能在于它可以在短時間內(nèi)關(guān)閉幾乎每一個特定的基因,因此適用于基因功能、藥物靶基因篩選及藥物靶點的驗證,現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療的研究。
4、目前,采用靶向的RNAi技術(shù)來研究RANKL基因功能及探索相關(guān)的骨代謝疾病的發(fā)病機(jī)制和基因治療,國內(nèi)外尚未見研究報道。保留人成骨細(xì)胞表型特征的MG63細(xì)胞株,近年被廣泛應(yīng)用于骨代謝疾病的研究。因此,本研究擬利用RNA干擾(RNAinterference,RNAi)技術(shù),從RANKL信號分子入手,設(shè)計靶向RANKL的短發(fā)夾RNA(smallhairpininterferenceRNA,shRNA),構(gòu)建慢病毒重組表達(dá)載體(RNAinter
5、ferenceusingalentivirus-basedsmallhairpinRNA,vshRNA),轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63,建立細(xì)胞感染模型;通過測定細(xì)胞內(nèi)RANKLmRNA及其蛋白表達(dá)水平,評價介導(dǎo)的RNAi對信號分子基因表達(dá)的沉默作用;動態(tài)觀察MG63細(xì)胞功能的變化(包括細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶(alkalinephosphatase,ALP)指標(biāo)、細(xì)胞內(nèi)OPGmRNA的表達(dá)),并研究與細(xì)胞功能相關(guān)基因p53、c
6、yclinD1、survivinmRNA表達(dá)的改變,探究RANKL基因?qū)G63細(xì)胞功能的影響及相關(guān)機(jī)制。 研究目標(biāo): 總體目標(biāo):靶向RANKL基因慢病毒載體系統(tǒng)的構(gòu)建,純化和篩選,并轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63,建立細(xì)胞模型;研究該慢病毒載體系統(tǒng)對目的細(xì)胞RANKLmRNA含量及蛋白表達(dá)的影響;在此基礎(chǔ)上,通過對細(xì)胞功能指標(biāo)及相關(guān)基因(p53、cyclinD1、survivinmRNA)表達(dá)水平的分析,初步探索RANKL基
7、因沉默對MG63細(xì)胞功能的影響及可能機(jī)制。包括: 1.RANKL基因RNA干擾慢病毒載體的設(shè)計、制備和包裝,獲得靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒重組載體系統(tǒng); 2.重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63,建立細(xì)胞模型; 3.通過WesternBlot和RealtimePCR分析,研究vshRNA慢病毒重組載體對MG63細(xì)胞RANKL基因表達(dá)的抑制作用; 4.通過分析細(xì)胞增殖率、細(xì)胞周期、細(xì)胞堿性磷酸酶
8、(ALP)活力、細(xì)胞內(nèi)OPGmRNA的表達(dá),研究RANKL基因?qū)G63細(xì)胞功能的影響; 5.通過細(xì)胞內(nèi)p53、cyclinD1、survivinmRNA表達(dá)改變的研究,探索RANKL基因敲減后MG63細(xì)胞功能變化的機(jī)制。研究內(nèi)容和方法第1章靶向RANKL基因的shRNA慢病毒重組質(zhì)粒載體的構(gòu)建目的旨在設(shè)計、構(gòu)建目的基因RANKL的RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 針對RANKL靶基因序列,利用Ambion網(wǎng)站按照RNA干擾序
9、列設(shè)計原則,設(shè)計多個RNA干擾靶點序列,選擇最佳的動力學(xué)參數(shù)靶點進(jìn)入后續(xù)實驗。研究內(nèi)容包括:合成含干擾序列的雙鏈DNAoligo(具有嚴(yán)格的檢測體系,PAGE純化體系),其兩端含酶切位點粘端,直接連入酶切后的RNA干擾載體上;將連接好的產(chǎn)物轉(zhuǎn)入制備好的細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞,對長出的克隆先進(jìn)行PCR鑒定;在進(jìn)行測序比對后,鑒定陽性的克隆即為構(gòu)建成功的目的基因RNA干擾慢病毒質(zhì)粒載體。 第2章靶向RANKL基因vshRNA慢病毒重組載體的
10、制備及病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立合成靶向RANKL基因的vshRNA慢病毒載體系統(tǒng)并轉(zhuǎn)染人成骨樣細(xì)胞MG63,建立細(xì)胞模型。 研究內(nèi)容包括:制備編碼慢病毒的重組病毒質(zhì)粒及其兩種輔助包裝原件載體質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞:收集富含慢病毒顆粒的細(xì)胞上清液,濃縮后獲得高滴度的慢病毒濃縮液,在293T細(xì)胞中測定并標(biāo)定病毒滴度:獲得的病毒顆粒轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞MG63,以建立細(xì)胞模型。 第3章vshRNA慢病毒重組載體對MG63細(xì)胞RANKL基
11、因抑制作用的研究通過Westernblot和RT-PCR研究其對于人成骨樣細(xì)胞MG63RANKL蛋白含量和基因表達(dá)的影響。 研究內(nèi)容包括:培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞(即MG63細(xì)胞),感染當(dāng)天按實驗設(shè)計的分組情況加入不同MOI(multipulyofinfection)的RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實驗;感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP/RFP表達(dá)情況,5天后采用Westernblot和RT-PCR的方法檢測MG63細(xì)胞
12、內(nèi)RNAKL蛋白和mRNA的表達(dá)情況,進(jìn)而判斷不同靶點的干擾效果。Real-timePCR數(shù)值分析采用2-△△Ct分析法;制圖軟件:GraphPadPRISM4.0。 第4章RANKL基因沉默對MG63細(xì)胞功能影響的實驗研究利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞,通過細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞ALP活力及OPGmRNA的表達(dá)水平,觀察RANKL基因沉默對MG63細(xì)胞功能的影響。 4.1細(xì)胞生長和增殖根據(jù)實驗需要設(shè)置組別,分別為空白
13、對照組(CON)、陰性病毒對照組(NC)和RANKL-vshRNA感染組(KD),每組各3個復(fù)孔。分別取4個時間點(是指病毒感染靶細(xì)胞后第5天開始接種細(xì)胞,檢測的時間點是其后連續(xù)的1、2、3、4天)進(jìn)行MTT實驗,通過OD值反映細(xì)胞的增殖和生長情況。 4.2細(xì)胞周期根據(jù)實驗需要設(shè)置組別,分別為CON組、NC組和KD組,每組各3個復(fù)孔。利用pGCL-GFEretro-3病毒感染MG63細(xì)胞,5天后開始接種細(xì)胞,利用細(xì)胞內(nèi)DNA能夠
14、和PI熒光染料結(jié)合的特性,細(xì)胞各個時期由于其DNA含量不同從而結(jié)合的熒光染料不同,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡,并通過熒光度確定各個時期細(xì)胞所占比例。 4.3細(xì)胞堿性磷酸酶(ALP)活力根據(jù)實驗需要設(shè)置組別,分別為CON、NC和KD,每組各3個復(fù)孔。分別取4個時間點(是指病毒感染靶細(xì)胞后第5天開始接種細(xì)胞,檢測的時間點是其后連續(xù)的1、2、3、4天),進(jìn)行ALP活力的測定。 4.4細(xì)胞OPGmRNA含量根據(jù)實驗需要設(shè)置組別,
15、分別為CON組、NC組和KD組,每組各3個復(fù)孔。培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的目的細(xì)胞,感染當(dāng)天按實驗設(shè)計的組別加入RNAi慢病毒顆粒進(jìn)行目的細(xì)胞的感染實驗。感染3天后熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá)情況,感染5天后收集細(xì)胞。采用RT-PCR的方法檢測OPGmRNA表達(dá)情況。 4.5結(jié)果統(tǒng)計采用軟件SPSS12.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量指標(biāo)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用MicrosoftExcel進(jìn)行作圖處理。Real-timePCR數(shù)
16、值分析采用2-△△Ct分析法,制圖軟件為GraphPadPRISM4.0。 第5章RANKL基因沉默對NG63細(xì)胞功能影響的機(jī)制初探在以上研究的基礎(chǔ)上,利用該病毒載體轉(zhuǎn)染MG63細(xì)胞,觀察細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞功能相關(guān)基因p53、survivin及cyclinD1mRNA的表達(dá)水平。 Real-timePCR檢測p53、survivin及cyclinD1基因mRNA的表達(dá)根據(jù)實驗需要設(shè)置組別,分別為CON組、NC組和KD組,每組各
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