抗腫瘤抗生素阿嗪霉素B和氯絲菌素的生物合成研究.pdf

1、阿嗪霉素B(Azinomycin B)又叫嗜癌霉素A，是1954年由日本科學(xué)家從Streptomycessahachiroi的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到的一種有良好的體內(nèi)抗腫瘤活性和潛在的體外細胞毒活性的天然化合物。后來又從另外一種鏈霉菌Streptomyces griseofuscus的發(fā)酵產(chǎn)物中也分離得到了Azinomycin B的其它結(jié)構(gòu)類似物(Azinomycins)，Azinomycins的結(jié)構(gòu)非常獨特，含有一個奈甲酸單元，一個環(huán)氧丙

2、烷結(jié)構(gòu)，還有現(xiàn)知化合物中獨一無二的氮雜雙環(huán)(1-azabicyclo[3.1.0]-hexane ring)結(jié)構(gòu)。其中Azinomycin B的活性最好，抗腫瘤活性與臨床應(yīng)用的絲裂霉素相當(dāng)。機理是通過環(huán)氧丙烷和氮丙啶烷基化DNA的嘌呤堿基，形成鏈間交聯(lián)，從而起到抑制細胞增殖的作用。Azinomycin B結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性，限制了其開發(fā)利用，利用化學(xué)方法改造其結(jié)構(gòu)成本高昂，組合生物合成的方法可以高效低成本的產(chǎn)生活性更好，結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定的Azin

3、omycin B的類似物。
　　 利用Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶(iterative typeⅠ polyketides，iPKS)的保守序列，設(shè)計兼并性引物，PCR擴增到Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶的DNA片段，并以之為探針篩選Azinomycin B的產(chǎn)生菌Streptomyces sahachiroi NRR2485的Cosmid基因組文庫，克隆到了基因組上約60kb的DNA序列，生物信息學(xué)分析顯示其為Azinomycin B的生物

4、合成基因簇，包含39個開放閱讀框。通過在異源宿主Streptomyces albus中單獨表達aziB，得到產(chǎn)物5-甲基萘甲酸，共表達aziB，aziB1，aziB2得到產(chǎn)物3-甲氧基-5-甲基萘甲酸，從而證明了克隆的DNA序列包含Azinomycin B的生物合成基因簇。通過同源重組的方法對ORF36進行了基因中斷后，還能檢測到Azinomycin B的產(chǎn)生。從而確定了Azinomycin B的生物合成基因簇的邊界。
　　 氯

5、絲菌素(Chlorothricin，CHL)是一個產(chǎn)生于S.antibioticus DSM40725的螺環(huán)乙酰乙酸內(nèi)酯家族抗生素，該家族天然產(chǎn)物具有廣泛生物活性(包括抗感染、抗腫瘤、抗瘧和膽固醇合成抑制等)，以Ⅰ型聚酮合成酶基因片段作為探針，結(jié)合染色體步移的方法克隆了S.antibioticus DSM40725染色體上122 kb左右的完整CHL生物合成基因簇。發(fā)現(xiàn)在其中chlB1編碼的是一個Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶。Azinomyc

6、in B生物合成基因簇中的aziB編碼的也是一個Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶。ChlB1和AziB1組織結(jié)構(gòu)相同，蛋白序列同源性高，但是ChlB1催化合成單環(huán)芳香化合物6-甲基水楊酸，而AziB催化合成雙環(huán)的5-甲基萘甲酸。以ChlB1和AziB為對象研究Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶的催化機制，對ChlB1和AziB的脫水功能域(DH domain)，酮基還原功能域(KR domain)的特異性位點突變，結(jié)果AziB的DH，KR的突變體中沒有檢測到

7、可能的中間體，而在ChlB1的947的H突變成F的DH突變體，檢測到6-甲基水楊酸，1540位的Y突變成F后的KR突變體產(chǎn)生了苔色酸(OSA)，說明在Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶的催化過程中DH的功能是重要的但不是必須的，KR的功能的缺失并不影響其進一步的延伸反應(yīng)。
　　 通過對Azinomycin B生物合成基因簇中p450羥化酶AziB1，氧甲基轉(zhuǎn)移酶AziB2，非核糖體聚肽合成酶(NRPS)AziA1的體外測活研究，證明了Azi

8、B1催化的是Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶的產(chǎn)物5-甲基萘甲酸C-3位置的羥化，AziB2催化的是接下來氧甲基化，最后有AziA1識別3-甲氧基-5-甲基萘甲酸并以之為起始單元，起始Azinomycin B的生物合成，證明了Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶AziB產(chǎn)物的后修飾是發(fā)生在游離小分水平上的，而不是發(fā)生在?；d體蛋白(ACP)連接的蛋白水平上的。
　　 氯絲菌素具有較好的抗菌和抗腫瘤活性，在前期的研究中發(fā)現(xiàn)的其Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶Chl

9、B1產(chǎn)物6-甲基水楊酸的后修飾是發(fā)生在ACP連接小分子的蛋白水平上的，在這個過程中，兩個酰基轉(zhuǎn)運蛋白(AT)ChlB3，ChlB6的底物容忍性相對寬泛，而且在對ChlB1這一Ⅰ型重復(fù)使用聚酮合成酶的機制研究的過程中，通過點突變KR結(jié)構(gòu)域的方法成功的把ChlB1這一六甲基水楊酸合成酶(6-MSAS)改造成了苔色酸合成酶(OSAS)，在這些基礎(chǔ)上，把ChlB1遺傳改造來的OSAS，導(dǎo)入到Chlorothricin產(chǎn)生菌S.antibioti