粘細菌的篩選及其產生的新型抗腫瘤抗生素.pdf

1、粘細菌(myxobacteria)是一類近年來引起廣泛關注，但卻研究尚少的重要藥源微生物類群。根據(jù)細胞形態(tài)學，粘細菌分為12個屬，約40個種。本課題在粘細菌傳統(tǒng)篩選方法的基礎上，采用高通量的試管培養(yǎng)方法，對分離的粘細菌進行了較大規(guī)模的篩選和初步鑒定，得到了376株粘細菌，并對其中的67株菌初步歸到屬。以埃坡霉素(Epothilones)的特征為篩選依據(jù)，篩選出在紫外區(qū)間掃描具有較強吸收的樣品312個。 以B16、SGC7901腫

2、瘤細胞系為篩選模型，對上述菌株經高通量定向篩選得到了45株產生高抑瘤活性物質的粘細菌菌株，復篩得到了六株菌，結合多種顯微技術對它們進行了鑒定與分類，WXNXJ-A為多囊菌屬(Polyangiumsp.)，WXNXJ-B為標樁菌屬(Stigmatellasp.)，WXNXJ-C為堆囊菌屬(Sorangiumsp.)，WXNXJ-D、WXNXJ-E為粘球菌屬(Myxococcussp.)，WXNXJ-F為囊孢桿菌屬(Cystobacters

3、p.)。 對六株粘細菌產物復篩的結果顯示，粘細菌菌株WXNXJ-A和WXNXJ-C代謝產生的物質不僅對小鼠黑色素瘤B16(IC50值，0.2715/0.0082μg/mL)、人胃腺癌SGC7901細胞株(IC50值，4.192/0.0362μg/mL)具有很高的抑制活性，而且對人肝癌Bel7402、人非小細胞肺癌H446、人乳腺癌MCF-7等細胞株也具有較高的抑制活性。 通過HPLC分析和LC/MS分析驗證了菌株WXNX

4、J-C發(fā)酵產物在HPLC分析的圖譜中保留時間tR=32.6min(flow：0.50mL/min)的物質是epothiloneB。 由優(yōu)化實驗研究了WXNXJ-C菌株最佳生長規(guī)律，確定細胞最佳生長時間為3d，發(fā)酵產生epothiloneB的最佳時間為6d，并確定了最佳發(fā)酵培養(yǎng)基組成以及氨基酸和微量元素的最佳添加量。培養(yǎng)基優(yōu)化后搖瓶發(fā)酵得到epothiloneB最高產量31.95mg/L。 WXNXJ-C菌株發(fā)酵產物中有7

5、個具有較高抗癌活性和較寬的抗腫瘤譜的物質。經C-18層析柱、15rpc柱、C-18制備柱等多次分離、純化，采用LC/MS、MALDI-TOF、MS/MS、IR、NMR等分析技術對7F組分進行結構分析，得到分子量為424Da的C22H32O8，系統(tǒng)名稱為[1R，7R，8R，10S，11S，12S，13S]-1，7，12，13-tetrahydroxy-14-methoxy-8，10-dimethyl-6-phenyl-5，15-dioxa

6、-bicyclo[9.3.1]pentadecan-4-one；1,7，12，13-四羥基-14-甲氧基-8，10-二甲基-6-苯基-5，15-二氧.雙環(huán)[9.3.1]十五烷-4-酮)，起名Phoxalone。查新確證Phoxalone是粘細菌WXNXJ-C產生的一種新型的含有15元環(huán)的大環(huán)內酯化合物。根據(jù)LC/MS、MALDI-TOFMS/MS分析結果，對Phoxalone的離子碎片進行了解析，構建了其分子離子結構，并對其可能產生的途

7、徑及機理進行了初步研究。 通過對Phoxalone、Soraphen、epothilones和Paclitaxel的構象進行比較分析，發(fā)現(xiàn)Phoxalone有7個手性C原子，2個手性對稱中心，結構更加簡單，有利于合成和修飾；與epothilone空間結構比較推測出二者在誘導細胞凋亡方面可能有相似的作用機制。 以B16、Bel7402、MCF-7、H446、SGC7901、L02等細胞系為篩選模型，對Phoxalone進行

8、的體外抑制腫瘤細胞實驗表明：Phoxalone不僅有較高的抗腫瘤活性和較廣的抗腫瘤譜，而且對人正常肝細胞的毒性也比較小。以人非小細胞肺癌H446細胞系為模型，經Phoxalone處理后，通過光學顯微鏡、掃描電鏡和熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)Phoxalone對H446細胞系具有較強的抑制作用。 對細胞凋亡周期的研究解釋了Phoxalone的作用機制，細胞經Phoxalone作用48h后在G2/M期被阻滯，能有效地誘導腫瘤細胞凋亡，且呈現(xiàn)量

9、效關系。以熒光染料PI和膜聯(lián)蛋白(annexin)V雙重染色作用的細胞，流式分析的結果表明，Phoxalone可能在不影響細胞膜完整性的情況下，誘導H446細胞線粒體△ψm下降，同樣證實了阻止細胞分裂在G2/M期。 通過對H446細胞系凋亡相關基因蛋白的表達分析表明，作用48h后Phoxalone通過上調H446細胞中促凋亡因子Bax、下調抑凋亡因子Bcl-2，以及上調線粒體依賴的Caspase-3，激活凋亡信號通路，誘導細胞凋