土壤中抗生素產(chǎn)生菌的基因篩選方法建立.pdf

1、從抗生素進入臨床50多年來，抗生素篩選取得了巨大成就，挽救了無數(shù)人的生命。從微生物中尋找新抗生素是目前抗生素的主要來源。然而傳統(tǒng)新抗生素篩選方法工作量大、周期長，尋找新物質(zhì)越來越難。目前，許多抗生素生物合成途徑化學結(jié)構(gòu)與目的基因相互關系研究透徹，為本研究奠定了基礎。本論文首次建立了從土壤中直接提取純化DNA，利用特異引物進行PCR.擴增的方法快速定向抗生素的篩選方法。
　　 本研究課題建立了5種從土壤中直接提取DNA的方法：改進

2、的Zhou法、改進的Bathe法、PVP法、改進的Marc法、液氮冷凍法；建立了3種土壤DNA純化方法：SephadexG-75/PVPP溶液法、膠回收試劑盒法、PVPP柱層析法。經(jīng)過比較，最終確立了液氮冷凍法和PVPP柱層析法作為簡單快速從提取純化土壤原核微生物基因組DNA的方法。純化后每克土壤可提取21.27～41.68/μg DNA。
　　 摻菌實驗驗證了篩選方法的靈敏性。摻菌實驗將摻入滅菌土壤中的菌株N022507平板計

3、數(shù)，液氮冷凍法和PVPP柱層析法提取純化后PCR擴增。每克土壤可以檢測到103個菌。證明了本研究的提取純化方法具有較高的靈敏度。
　　 利用SSCP方法驗證了篩選方法的靈敏性和多樣性。將10株菌提取的DNA為模板的PCR產(chǎn)物與10株菌摻入到滅菌土壤中再提取、純化DNA為模板的PCR產(chǎn)物做SSCP，二者的聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶相似，無明顯差別。說明提取純化土壤DNA的方法得’到的DNA的多樣性較好，可將不同菌的DNA從土壤中提取純

4、化出來。
　　 利用整個篩選過程的模擬實驗進一步驗證了篩選方法的可行性。在對整個篩選過程的模擬實驗中分別在土壤中摻入了除莠霉素產(chǎn)生菌N022507和格爾德霉素產(chǎn)生菌N062821，從土壤中提取純化DNA作為模板均可用特異引物PCR.擴增證明為陽性。而且從摻菌的土壤中可以分離菌得到了N022507和N062821。
　　 隨機摻入陽性菌株的土樣的篩選實驗將無標記的7份土壤樣品中的1份摻入N022507，篩選得到了1個陽性結(jié)