藥物中揮發(fā)性成分樣品前處理方法的研究與應(yīng)用.pdf

1、藥物中的揮發(fā)性成分的分析測(cè)定常需采用一定的樣品前處理方法進(jìn)行萃取、分離、純化、富集后再利用色譜法測(cè)定，以減少干擾成分及對(duì)色譜系統(tǒng)的損害等。傳統(tǒng)的萃取純化方法有液液萃取，如揮發(fā)油提取器提取法、水蒸氣蒸餾萃取法、超聲法和索氏提取法等，但這些方法均存在使用大量有機(jī)溶劑，提取時(shí)間長(zhǎng)，提取效率低，操作步驟繁雜，暴露機(jī)會(huì)較多，易造成揮發(fā)成分的損失，使樣品的信息失真等缺點(diǎn)。近年來，固相萃取及固相微萃取技術(shù)雖然已用于藥物中的揮發(fā)性成分的含量測(cè)定，但其萃

2、取裝置的萃取頭涂層種類少，價(jià)格昂貴，且使用壽命短，多次使用還存在交叉污染的問題。因此，需建立簡(jiǎn)單快速、密閉準(zhǔn)確、選擇性高、環(huán)境友好的樣品前處理方法用于分析檢測(cè)藥物中的揮發(fā)性成分。
　　 近年來項(xiàng)空技術(shù)憑借其裝置簡(jiǎn)單，成本低，氣體進(jìn)樣，對(duì)色譜系統(tǒng)污染少，且分析速度快，靈敏度高等特點(diǎn)越來越多地應(yīng)用于藥物中有機(jī)溶劑殘留的分析檢測(cè)。頂空氣相色譜法(HS-GC)中頂空溶劑的合理選擇是關(guān)鍵，一個(gè)合適的頂空溶劑首先要溶解藥物及待測(cè)成分，其次要

3、有理想的頂空效率，即靈敏度要高。水是最傳統(tǒng)的頂空溶劑，也是水溶性藥物最理想的頂空溶劑，因此，本文首先建立了以水為頂空溶劑的HS-GC分析檢測(cè)藿香正氣口服液中乙醇的殘留量的方法，這是因?yàn)樗幬镛较阏龤饪诜杭按郎y(cè)溶劑乙醇均易溶于水，且水作為頂空溶劑無污染，也避免了使用其他高沸點(diǎn)的頂空溶劑如N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲基亞砜(DMSO)等時(shí)由于在頂空時(shí)揮發(fā)產(chǎn)生極大的溶劑峰干擾待測(cè)組分的測(cè)定。該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏，既減少了對(duì)待測(cè)物的干

4、擾，又不污染色譜系統(tǒng)，適用于藿香正氣口服液中乙醇?xì)埩舻暮繙y(cè)定。
　　 雖然水是理想的頂空溶劑，因其對(duì)水不溶性待測(cè)組分具有憎水作用而表現(xiàn)出良好的頂空效率。針對(duì)水不溶性的藥物和待測(cè)組分，雖然可以使用的其他的高沸點(diǎn)的傳統(tǒng)頂空溶劑DMF、DMSO等，但它們?cè)陧斂諘r(shí)隨待測(cè)組分一起揮發(fā)，不僅會(huì)產(chǎn)生寬大的色譜峰干擾檢測(cè)，其加熱時(shí)也不穩(wěn)定會(huì)分解產(chǎn)生揮發(fā)性雜質(zhì)，因而檢測(cè)需扣除“溶劑空白”，既麻煩又易引入誤差。如果解決了水不溶性藥物及待測(cè)組分在水

5、中的溶解分散問題，水這一理想的頂空溶劑會(huì)在很多藥物的揮發(fā)性的分析檢測(cè)中得到應(yīng)用。
　　 本文采用以水為頂空溶劑加入少量改性劑-甲醇的方法，建立了分析檢測(cè)百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯含量的HS-GC，改性劑充分溶解藥物基質(zhì)后再加入水中能使藥物迅速分散在水中，同時(shí)甲醇在頂空溶劑中所占比例很少，進(jìn)入色譜柱的量相對(duì)較小，而且甲醇保留時(shí)間也較短，不干擾測(cè)定，適用于羅浮山百草油的質(zhì)量控制。在水中加入少量改性劑的方法雖然解決了待測(cè)組分的溶解分散

6、問題，但仍存在的缺點(diǎn)是少量的改性劑-甲醇易揮發(fā)略影響待測(cè)組分的頂空效率，通過綜合考慮頂空溶劑對(duì)藥物及待測(cè)成分的溶解性及頂空效率，我們建立了以0.1％的聚山梨酯80水溶液為頂空溶劑的HS-GC分析檢測(cè)萘敏維滴眼液中薄荷醇含量的方法，表面活性劑-聚山梨酯80的加入，既增大薄荷醇在水中的溶解度，又保證了較高的頂空效率，靈敏度高，而且聚山梨酯80不揮發(fā)，不干擾檢測(cè)，0.1％的聚山梨酯80水溶液有望成為分析檢測(cè)脂溶性藥物及待測(cè)揮發(fā)性成分的理想頂空

7、溶劑。
　　 近年來，離子液體作為一種新型溶劑，憑借其非揮發(fā)性和高溶解性的特點(diǎn)已成為頂空溶劑的研究熱點(diǎn)，本課題組己在以往的研究中采用多種離子液體作為頂空溶劑的HS-GC分析檢測(cè)了藥物中的有機(jī)溶劑殘留，但目前離子液體的種類繁多，致使人們?cè)趹?yīng)用時(shí)面對(duì)龐大的離子液體家族無從選擇，主要停留在“嘗試-比較-篩選”的階段，這不僅會(huì)造成時(shí)間、精力及成本的浪費(fèi)，而且不能達(dá)到最佳的理想效果。但離子液體在HS-GC的理論研究缺乏，特別是其對(duì)某些有機(jī)

8、溶劑的頂空分配行為的研究方面缺少理論指導(dǎo)，因此本文研究了三種離子液體作為頂空溶劑對(duì)八種醇類有機(jī)溶劑的分配行為，初步建立了頂空分配系數(shù)與溶劑的物理性質(zhì)相互關(guān)聯(lián)的數(shù)學(xué)模型，為以后HS-GC分析檢測(cè)有機(jī)溶劑時(shí)選擇合適的離子液體提高方法的靈敏度提供了理論基礎(chǔ)。該方法可以擴(kuò)展到更多的離子液體和有機(jī)溶劑，通過進(jìn)一步優(yōu)化模型的參數(shù)，逐漸揭示離子液體對(duì)待測(cè)溶劑的頂空分配規(guī)律，以此指導(dǎo)正確合理的選用離子液體。該部分研究正在進(jìn)行中。
　　 通過對(duì)傳

9、統(tǒng)溶劑水的改性行為的研究，解決了待測(cè)藥物及組分的溶解分散問題，又保證了頂空效率，建立了HS-GC分析檢測(cè)藥物中各種揮發(fā)性成分含量的方法，避免了傳統(tǒng)方法的諸多不足，但仍存在一些缺點(diǎn)，如待測(cè)組分僅通過與頂空溶劑分配后即進(jìn)樣檢測(cè)，限制了靈敏度的提高。為進(jìn)一步提高方法的靈敏度，我們嘗試建立頂空單滴微萃取(HS-SDME)的方法分析檢測(cè)藥物中的揮發(fā)性成分，這樣待測(cè)組分經(jīng)過二次分配與富集，靈敏度更高，更適合分析檢測(cè)成分復(fù)雜的藥物中的揮發(fā)性成分。該法

10、集揮發(fā)性成分的分離、純化與富集為一體，既可以減少干擾成分，又避免了對(duì)后續(xù)色譜檢測(cè)系統(tǒng)的污染，是簡(jiǎn)便、快速和靈敏的樣品前處理新技術(shù)。
　　 因此本文在已建立了分析檢測(cè)百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯含量的HS-GC的基礎(chǔ)上，仍通過考察優(yōu)化HS-SDME的萃取條件，建立了以DMF為萃取溶液的HS-SDME-GC分析測(cè)定了百草油中的二主成分的含量，該法避免了傳統(tǒng)方法的諸多不足，操作簡(jiǎn)單，分析成本低，在密閉容器中僅5min即完成了萃取純化過程

11、，分析速度快，且靈敏度更高。
　　 HS-SDME雖然優(yōu)點(diǎn)多但也存在一些缺點(diǎn)，例如萃取的溶劑多為有機(jī)溶劑，萃取液滴體積小，易揮發(fā)，不易高溫萃取且萃取維持時(shí)間短等。因此本文充分利用離子液體的非揮發(fā)性、溶解性能高、較大的黏度和密度等特性特性，設(shè)計(jì)了離子液體-單滴微萃取技術(shù)應(yīng)用于藥物中的高沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分的分析測(cè)定，并對(duì)單滴的懸滴裝置的改進(jìn)，增大了液滴的體積，從而提高了液滴的穩(wěn)定性和方法的靈敏度，使得改進(jìn)的方法可用于可在高溫下大液滴長(zhǎng)

12、時(shí)間萃取分析藥物中的高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分，最終采用此法分析測(cè)定了復(fù)方鮮竹瀝液中愈創(chuàng)木酚的含量及復(fù)方甘草片中樟腦和反式茴香腦的含量，避免了傳統(tǒng)萃取方法的缺點(diǎn)，直接進(jìn)樣HPLC分析測(cè)定，操作簡(jiǎn)單快速，結(jié)果準(zhǔn)確，環(huán)境友好。
　　 綜上研究，本文建立的藥物中揮發(fā)性成分的分析檢測(cè)的新的樣品前處理方法，彌補(bǔ)以往樣品前處理的不足，為藥物中揮發(fā)性成分的質(zhì)量控制提供簡(jiǎn)便、快速、靈敏的前處理手段。
　　 第一部分、傳統(tǒng)頂空溶劑HS-GC在藥物中

13、揮發(fā)性成分的分析研究與應(yīng)用
　　 一、水為頂空溶劑HS-GC測(cè)定藿香正氣口服液著乙醇?xì)埩袅?br>　　 目的：解決直接進(jìn)樣對(duì)色譜系統(tǒng)的污染及對(duì)待測(cè)物的干擾問題，建立HS-GC測(cè)定藿香正氣口服液中殘留溶劑乙醇的含量。
　　 方法：以水為頂空溶劑，在80℃的頂空溫度下頂空平衡25min，抽取上部頂部氣體0.5mL進(jìn)樣測(cè)定。采用DM-WAX毛細(xì)管柱(30m×0.32mm×0.25μm），柱溫：70℃；進(jìn)樣口溫度：150℃；F

14、ID檢測(cè)器，溫度：200℃。
　　 結(jié)果：該法避免了直接進(jìn)樣的諸多不足，線性范圍寬、回收率好、靈敏度高。方法驗(yàn)證表明被測(cè)溶劑乙醇在1.95～5.00×102μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9999)，平均回收率為96.5％(RSD=1.5％)，檢測(cè)限達(dá)0.122μg·mL-1。
　　 結(jié)論：該方法簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確、靈敏，以水作為項(xiàng)空溶劑，避免了其他高沸點(diǎn)的頂空溶劑如DMF、DMSO等在頂空時(shí)揮發(fā)產(chǎn)生極大的溶劑峰干擾

15、待測(cè)組分的測(cè)定，又不污染色譜系統(tǒng)，適用于藿香正氣口服液中乙醇?xì)埩舻暮繙y(cè)定。
　　 二、加改性劑的水為頂空溶劑的HS-GC測(cè)定羅浮山百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯的含量
　　 目的：通過加入改性劑的方法，解決脂溶性藥物百草油及揮發(fā)性成分百草油和水楊酸甲酯的溶解問題，建立一種簡(jiǎn)單快速的HS-GC測(cè)定羅浮山百草油中薄荷腦和水楊酸甲酯含量。
　　 方法：將樣品的甲醇溶液50μL直接注入2mL水中頂空分析，在80℃的頂空溫度

16、下頂空平衡30min，抽取上部頂部氣體1.0mL進(jìn)樣測(cè)定。采用SMA-WAX（30m×0.53mm×0.50μm）的毛細(xì)管柱，聚乙二醇為固定液，程序升溫，起始溫度100℃保持3min，4℃/min升到112℃，再以10℃/min到152℃，保持5min;進(jìn)樣口溫度：200℃；FID檢測(cè)器溫度：230℃。
　　 結(jié)果：該法避免了復(fù)雜的樣品前處理，薄荷腦、水楊酸甲酯和其他成分的分離度良好，其加樣回收率分別為99.2％和98.1％，R

17、SD分別為0.5％和0.9％。薄荷腦和水楊酸甲酯分別在62.4～9.98×102μg·mL-1和1.25×102～2.00×103μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，r均大于0.9990。兩種成分的檢測(cè)限分別為1.95μg·mL-、7.81μg·mL-1。
　　 結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單快速，定量準(zhǔn)確，改性劑-甲醇的加入既解決了樣品的溶解問題，同時(shí)其在頂空溶劑中所占分?jǐn)?shù)較小，進(jìn)入色譜柱的量相對(duì)較小，而且甲醇保留時(shí)間也較短，不干擾測(cè)定

18、，該法適用于羅浮山百草油的質(zhì)量控制。
　　 三、加入增溶劑的水為頂空溶劑的HS-GC測(cè)定萘敏維滴眼液中薄荷醇的含量
　　 目的：采用加入增溶劑聚山梨酯80的方法，解決薄荷醇的溶解問題和提高方法的靈敏度，建立簡(jiǎn)單快速的HS-GC分析檢測(cè)萘敏維滴眼液中的微量薄荷醇含量。
　　 方法：以0.1％聚山梨酯80溶液為頂空溶劑，在85℃頂空平衡20min，抽取頂空氣體1.0mL進(jìn)樣測(cè)定。采用SMA-WAX毛細(xì)管柱(30m×0

19、.53mm×0.50μm)，固定液聚乙二醇；柱溫125℃；進(jìn)樣口溫度150℃；FID檢測(cè)器溫度170℃。
　　 結(jié)果：該法避免了復(fù)雜的樣品前處理，回收率和重現(xiàn)性良好、待測(cè)組分達(dá)到了高富集，方法的靈敏度高。方法驗(yàn)證表明薄荷醇在2.4～76.8μg·mL-1濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9994)，回收率在100.4～101.1％，RSD小于1.5％，薄荷醇的檢測(cè)限達(dá)9.45μg·L-1。
　　 結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單快速，

20、定量準(zhǔn)確，0.1％的聚山梨酯80溶液為頂空溶劑，既增大薄荷醇在水中的溶解度，又保證了較高的頂空效率，靈敏度高，可用于制劑中微量薄荷醇的質(zhì)量控制。
　　 第二部分、新型頂空溶劑-離子液體HS-GC在藥物中揮發(fā)性成分-有機(jī)殘留溶劑的分配行為的理論研究
　　 定量預(yù)測(cè)離子液體-頂空空間分配系數(shù)的模型的建立
　　 目的：通過采用HS-GC研究某些有機(jī)溶劑在離子液體和頂空空間的分配行為，建立對(duì)待測(cè)溶劑具有理想頂空分配行為的

21、離子液體模型。
　　 方法：以三種常用的咪唑基離子液體為頂空溶劑分析檢測(cè)八種醇類溶劑，在100℃的頂空溫度下頂空平衡時(shí)間30min，氣體進(jìn)樣0.5mL。采用ZM-1毛細(xì)管柱（60m×0.53mm×5.00μm），起始柱溫為50℃，保持2min，以5℃/min升至130℃保持2min;進(jìn)樣口溫度：180℃；FID檢測(cè)器，溫度：200℃。
　　 結(jié)果：通過實(shí)驗(yàn)計(jì)算得出頂空分配系數(shù)，采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS13.0分析處理各種參數(shù)

22、的關(guān)系，建立了可用于預(yù)測(cè)離子液體-項(xiàng)空空間分配系數(shù)的模型，模型中引入了溶劑的物理性質(zhì)參數(shù)-沸點(diǎn)和油水分配系數(shù)，并得到了三個(gè)回歸方程，相關(guān)系數(shù)均大于0.988。
　　 結(jié)論：該方法可以用于更多的離子液體和有機(jī)溶劑，因?yàn)榉峙湎禂?shù)與方法的靈敏度成反比，離子液體分配模型的建立對(duì)簡(jiǎn)單快速選擇合適的離子液體作為頂空溶劑檢測(cè)有機(jī)殘留溶劑具有重要意義。
　　 第三部分、HS-SDME在藥物中揮發(fā)性成分的分析研究與應(yīng)用
　　 一、

23、DMF為萃取溶劑的HS-SDME-GC快速分析百草油中揮發(fā)性成分的含量
　　 目的：進(jìn)一步改善直接HS-GC的靈敏度，采用簡(jiǎn)單、快速、靈敏的HS-SDME-GC分析測(cè)定百草油中揮發(fā)性成分薄荷醇和水楊酸甲酯含量。
　　 方法：精密吸取樣品的甲醇溶液10μL注入盛有5mL水的樣品瓶中，以1.5μLDMF為萃取溶液（含內(nèi)標(biāo)苯甲醇），萃取溫度為40℃、萃取時(shí)間為5min，萃取后直接吸回0.5μL進(jìn)樣GC分析檢測(cè)。采用30m×0.

24、53mmPEG毛細(xì)管柱，其他色譜條件見第一部分（二）。
　　 結(jié)果：該方法的薄荷醇、水楊酸甲酯和其他成分的分離度良好，加樣回收率在95.4％～99.2％之間，RSD均低于1.9％。薄荷醇和水楊酸甲酯分別在1.26～80.5μg·mL-1(r=0.9990)和2.48～1.59×102μg·mL-1(r=0.9991)的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。兩種成分的最低檢測(cè)限分別為7.86×10-2μg·mL-1、0.156μg·mL-1，較直接

25、HS-GC的靈敏度更高。
　　 結(jié)論：該方法避免了復(fù)雜的樣品前處理，操作簡(jiǎn)單快速，僅5min即完成萃取、純化，適用于中藥及其制劑中揮發(fā)性成分的含量測(cè)定。
　　 二、新型離子液體為萃取溶劑的HS-SDME-HPLC分析測(cè)定中藥中的高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分
　　 目的：充分利用離子液體的非揮發(fā)性、溶解性能高、較大的黏度和密度等特性特性，設(shè)計(jì)了離子液體HS-SDME技術(shù)應(yīng)用于藥物中的高沸點(diǎn)的揮發(fā)性成分的分析測(cè)定，避免常用萃取有

26、機(jī)溶劑萃取液滴體積小，易揮發(fā)，不易高溫萃取且萃取維持時(shí)間短等缺點(diǎn)，并改進(jìn)單滴的懸滴裝置，提高液滴的穩(wěn)定性和方法的靈敏度，使HS-SDME可用于高溫下大液滴長(zhǎng)時(shí)間萃取分析藥物中的高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分，并分析測(cè)定復(fù)方鮮竹瀝液中愈創(chuàng)木酚的含量。
　　 方法：通過改進(jìn)懸滴裝置，增大了液滴與微量進(jìn)樣器針尖處塑料套管的接觸面積，使離子液體的液滴體積達(dá)12μL，提高了液滴的穩(wěn)定性及方法的靈敏度。以12μL1-丁基-3-甲基咪唑基六氟磷酸鹽([BM

27、IM][PF6])為懸滴，在5mL含36％(w/v)NaCl的樣品液中，萃取溫度80℃、攪拌速度1000rpm的條件下，頂空萃取30min，萃取后直接將液滴吸回微量進(jìn)樣器，進(jìn)樣HPLC分析檢測(cè)。色譜柱：KromasilC18柱(150×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：1％冰醋酸水溶液：甲醇（體積比70:30）；流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：274nm;柱溫：室溫。
　　 結(jié)果：該法避免了傳統(tǒng)方法的不足，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高。方

28、法驗(yàn)證表明愈創(chuàng)木酚在5.04×10-2～1.61μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.9997），檢出限為0.394μg·L-1，愈創(chuàng)木酚的加樣回收率為97.6％，RSD為2.5％。
　　 結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)單快速，定量準(zhǔn)確，成本低，無污染，且避免了復(fù)雜的樣品前處理，解決了傳統(tǒng)萃取溶劑及原有萃取裝置的諸多不足，適用于分析測(cè)定藥物中的高沸點(diǎn)揮發(fā)性成分的含量。
　　 三、新型離子液體為萃取溶劑的HS-SDME-HPLC

29、分析測(cè)定復(fù)方甘草片中的樟腦和反式茴香腦的含量
　　 目的：充分利用離子液體的特性及改進(jìn)的懸滴裝置，建立了一種離子液體HS-SDME-HPLC分析測(cè)定復(fù)方甘草片中樟腦和反式茴香腦的含量。
　　 方法：通過改進(jìn)懸滴裝置，增大了液滴與微量進(jìn)樣器針尖處塑料套管的接觸面積，使離子液體的液滴體積達(dá)12μL，提高了液滴的穩(wěn)定性及方法的靈敏度。通過系統(tǒng)考察影響離子液體頂空單滴微萃取的因素（離子液體類型，液滴體積，轉(zhuǎn)速，離子強(qiáng)度，萃取溫度

30、和萃取時(shí)間），確立了最佳的萃取條件后進(jìn)樣HPLC分析檢測(cè)。液相色譜條件為色譜柱：PromosilC18柱(150mm×4.6mm，5μm)，流動(dòng)相：甲醇：水（體積比70:30）；流速：1.0mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)：289nm;柱溫：35℃。
　　 結(jié)果：樟腦和反式茴香腦均在0.156～10.0μg·mL-1的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.9990，0.9998)，樟腦和反式茴香腦的回收率為98.5～101.2％，RSD均低于4.2