硼替佐米對大鼠破骨細(xì)胞的影響.pdf

1、目的：通過RANKL定向誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞為破骨細(xì)胞的方式建立破骨細(xì)胞模型，并對該細(xì)胞進(jìn)行鑒定：由于硼替佐米可以通過影響骨髓瘤細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞因子表達(dá)而間接影響到破骨細(xì)胞的分化成熟和功能，為進(jìn)一步探討其直接影響破骨細(xì)胞的分化的作用，并對破骨細(xì)胞的標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）活力進(jìn)行測定以觀察硼替佐米對破骨細(xì)胞功能影響。
　　方法：1、把RAW264.7細(xì)胞以1×105/ml的密度接種于培養(yǎng)瓶內(nèi)，預(yù)先將紫外照射過的圓形玻片

2、置于48孔板，設(shè)置5-6個(gè)復(fù)孔，是培養(yǎng)過夜后（細(xì)胞附上玻片），倒去培養(yǎng)液，換200μl的50 ng/ml的RANKL誘導(dǎo)，細(xì)胞每3 d換液1次。第3、6、9天分別取出圓玻片，用抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒染色，光鏡下觀察多核細(xì)胞的形態(tài)學(xué)及組織化學(xué)特點(diǎn)。2、觀察在小鼠破骨細(xì)胞株體外誘導(dǎo)分化成熟過程中，硼替佐米對其分化和功能的影響。在誘導(dǎo)向破骨細(xì)胞分化過程中，采用 A組和 B組骨板骨吸收情況對比的方法：A組和 B組的細(xì)胞密度為105

3、/ml，A組的RAW264.7用100ng/ml的RANKL誘導(dǎo)分化，3天換液1次；B組的細(xì)胞培養(yǎng)基里除了含有100ng/ml的RANKL，還有10.0nM/ml的硼替佐米，3天換液1次，第14天觀察到骨片上骨陷窩的，與對照組比較，得出結(jié)論。3、將細(xì)胞以1*105的密度鋪在48孔培養(yǎng)板上，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)過夜后，換含有sRANKL和硼替佐米的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)，使RANKL的濃度為50ng/ml，硼替佐米濃度分別為0.1nM/ml,1nM/

4、ml,10nM/ml，培養(yǎng)9天后取上清液待測。用抗酒石酸酸性磷酸酶測試盒測量OD值并計(jì)算出活性值，
　　結(jié)果:1、誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后可見少量活性良好的破骨樣細(xì)胞，胞質(zhì)內(nèi)可見透亮區(qū)，且胞質(zhì)內(nèi)含許多紅色陽性顆粒，此為TRAP染色(十)顆粒，細(xì)胞內(nèi)可見淡染的雙核，三個(gè)核以上的細(xì)胞未觀察到。誘導(dǎo)培養(yǎng)6天后可見大量TRAP染色(+)破骨樣細(xì)胞，此時(shí)細(xì)胞核仍以雙核為主，可見少量多核細(xì)胞。誘導(dǎo)培養(yǎng)9天后出現(xiàn)多核巨型TRAP染色(+)破骨樣細(xì)胞，細(xì)胞

5、較第3，6天明顯增大，細(xì)胞核可達(dá)到3個(gè)以上。2、通過A組和B組骨吸收面積對比，發(fā)現(xiàn)硼替佐米干預(yù)的B組面積明顯少于無硼替佐米干預(yù)的A組。3、硼替佐米降低了小鼠破骨細(xì)胞中的trap活性。TRAP是破骨細(xì)胞標(biāo)志物，它的降低說明硼替佐米可以抑制破骨細(xì)胞成熟，減少破骨作用。
　　結(jié)論：1、RANKL成功地把 RAW264.7細(xì)胞定向誘導(dǎo)成為破骨細(xì)胞。2、硼替佐米能顯著的減少破骨細(xì)胞骨質(zhì)破壞作用。3、硼替佐米可以通過抑制TRAP分泌而達(dá)到抑制