動態(tài)增強核磁共振顯像監(jiān)測硼替佐米對腫瘤微循環(huán)的影響.pdf

1、[研究目的]:新一代多靶向抗腫瘤藥物蛋白酶體抑制劑硼替佐米已被批準用于多發(fā)性骨髓瘤和蔓狀細胞淋巴瘤的臨床治療，但其在實體瘤的應用尚處臨床試驗階段，明確其抗實體瘤的關鍵生物學機制、建立早期療效評價指標、早期篩選對治療有效的患者是治療成功與否的關鍵。體外研究發(fā)現(xiàn)硼替佐米對乏氧狀態(tài)下的腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞均有較強的選擇性細胞毒性作用;臨床活檢標本發(fā)現(xiàn)其顯著抑制細胞乏氧應答，降低細胞應對乏氧負荷的能力;血管內(nèi)皮細胞的損傷可能影響微血管的功能，

2、降低微循環(huán)血流，進一步加重腫瘤細胞的損傷。本研究擬1）在組織學水平明確治療前腫瘤乏氧微環(huán)境在硼替佐米治療腫瘤中的作用以及硼替佐米對腫瘤微循環(huán)的影響;2）探討通過動態(tài)增強核磁共振顯像監(jiān)測硼替佐米對腫瘤微循環(huán)的影響，進而間接反映硼替佐米抗腫瘤生物學效應的可行性。
　　 [研究方法]:應用已建立的含雙乏氧應答報告基因-9個乏氧反應元件(hypoxia response element, HRE)驅(qū)動的單純皰疹病毒1胸苷激酶(herpe

3、ssimplex virus type1 thymidine kinase，HSV1-TK)和增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescence protein，eGFP)融合基因的HT29人結(jié)直腸癌細胞株(HT29-9HRE-TKeGFP，簡稱HT29-9HRE)及其移植瘤模型進行如下研究。1）體外實驗:驗證硼替佐米能夠有效抑制HT29-9HRE細胞的乏氧應答。常氧(21％ O2)/乏氧(0.2％O2)條件下培

4、養(yǎng)，同時給予不同藥物濃度的硼替佐米治療，流式細胞儀檢測乏氧應答報告基因eGFP的表達，液體閃爍儀測定乏氧應答報告基因TK的功能，蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測乏氧誘導因子-1α亞單位（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α)及乏氧應答下游產(chǎn)物碳酸酐酶9(carbonic anhydrase9，CA9)的表達，酶聯(lián)免疫吸附法測定乏氧應答下游產(chǎn)物血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth f

5、actor，VEGF)的濃度，每項實驗至少重復三次。2）體內(nèi)實驗:在組織學水平明確治療前腫瘤乏氧微環(huán)境在硼替佐米抗腫瘤中的作用及其與乏氧應答抑制之間的關系，以及硼替佐米對腫瘤微循環(huán)的作用。右下肢皮下荷HT29-9HRE移植瘤裸鼠隨機分為硼替佐米(2mg/kg)治療組或PBS對照組（8～10只/組）。荷瘤鼠于治療前2小時、治療后20小時和治療后24小時分別被給予外源性乏氧示蹤劑pimonidazole、外源性乏氧示蹤劑EF5、血流示蹤劑H

6、oechst33342，1分鐘后處死。隨后即刻取瘤、包埋、冰凍、固定、常規(guī)/熒光免疫組化染色、顯微鏡檢查，并行以下分析:①評價硼替佐米對HT29-9HRE移植瘤的抗腫瘤療效及其對腫瘤微循環(huán)的作用——定量分析硼替佐米/PBS治療后24小時，腫瘤整體、腫瘤細胞、腫瘤血管內(nèi)皮細胞的凋亡標志物cleaved caspase3(CCP3)陽性百分比（即整體凋亡率、腫瘤細胞凋亡率和腫瘤血管內(nèi)皮細胞凋亡率）;定性觀察發(fā)生凋亡的腫瘤血管內(nèi)皮細胞所處微血

7、管的組織學形態(tài)特征及凋亡對局部微血管功能（即血流灌注）的影響;定量分析硼替佐米治療后腫瘤血流示蹤劑Hoechst33342的陽性百分比。②分析硼替佐米的抗腫瘤效應與腫瘤局部乏氧微環(huán)境和乏氧應答抑制間的關系——將腫瘤大體組織切片顯微鏡圖像劃分為一系列1×1 mm2的微小區(qū)域，依據(jù)第一個乏氧示蹤劑pimonidazole在各區(qū)域內(nèi)的分布情況，將腫瘤局部微環(huán)境的初始乏氧程度分為輕(＜10％)、中(＞10％)、重(＞20％)三度。定性、定量分析

8、不同初始乏氧程度腫瘤微環(huán)境內(nèi)，硼替佐米治療組和PBS對照組的凋亡標記物CCP3（抗腫瘤效應）、內(nèi)皮細胞標記物CD31（微血管的形態(tài)）、血流示蹤劑Hoechst33342（微循環(huán)功能）、兩個乏氧示蹤劑pimonidazole和EF5（乏氧的動態(tài)變化）、以及乏氧應答下游產(chǎn)物CA9（乏氧應答情況）空間分布的差異。3）動態(tài)增強核磁共振顯像(Dynamic contrast enhanced magneticresonance imaging，D

9、CE MRI):活體監(jiān)測硼替佐米治療后腫瘤血流的動態(tài)變化。右季肋部皮下荷HT29-9HRE移植瘤裸鼠，應用自制1H MR螺線圈，行移植瘤局部初始DCE MRI檢查，隨后隨機分為非治療組、單劑量(2mg/kg)治療組和雙劑量（1.5mg/kg，兩次給藥間隔24小時）治療組（6～8只/組），并分別于初次給藥后24小時和48小時再次行移植瘤局部DCE MRI檢查，分別評價硼替佐米連續(xù)治療對腫瘤微循環(huán)的持續(xù)影響，以及單次治療后腫瘤微循環(huán)的動態(tài)變

10、化。定性、定量評價指標:獲取DCE MRI圖像各體素時間-信號強度曲線，應用Hoffman模型擬合計算其幅度A與交換率kep的乘積（簡稱Akep），間接定量腫瘤組織各體素的血流/灌注量，并生成相應腫瘤層面MR圖像的Akep偽彩圖，反映腫瘤的血流分布;根據(jù)腫瘤全部體素的Akep分布直方圖，獲取其中位數(shù)值(median Akep)代表腫瘤的平均血流量。4）結(jié)合離體實驗，驗證DCE MRI顯像結(jié)果與硼替佐米抗腫瘤生物學效應間的關系。末次DCE

11、 MRI結(jié)束2小時后尾靜脈注射血流示蹤劑Hoechst33342，1分鐘后處死，隨后重復前述組織學實驗步驟。定性比較血流示蹤劑Hoechst33342顯微鏡圖像與DCE MRI的Akep偽彩圖對腫瘤微循環(huán)的顯示;定性分析硼替佐米治療后腫瘤微循環(huán)和乏氧應答的動態(tài)變化;探討應用DCE MRI顯像評價硼替佐米抗腫瘤生物學效應的可行性。
　　 [結(jié)果]:1）體外實驗:證實硼替佐米阻斷HIF-1α在HT29-9HRE細胞內(nèi)的降解，并抑制H

12、IF乏氧應答。經(jīng)硼替佐米治療后，有氧和乏氧培養(yǎng)條件下，細胞內(nèi)的HIF-1α均明顯堆積，乏氧狀態(tài)下更為顯著。HIF-1α的堆積卻不能啟動有效的乏氧應答:乏氧培養(yǎng)的HT29-9HRE細胞乏氧應答報告基因產(chǎn)物eGFP的表達和TK的功能均降至常氧培養(yǎng)水平;乏氧應答下游產(chǎn)物CA9和VEGF的產(chǎn)量也降低至常氧水平。2）體內(nèi)實驗:①硼替佐米治療后，HT29-9HRE移植瘤的凋亡率顯著升高，其中血管內(nèi)皮細胞的凋亡導致血流灌注量顯著降低。治療組和非治療組

13、凋亡標記物CCP3陽性百分比分別為5.26％±0.98％和0.58％±0.13％(P＜0.001);其中非治療組CCP3僅分布在腫瘤細胞內(nèi);治療組3.28％±0.63％的CCP3位于腫瘤血管內(nèi)皮細胞，1.98％±0.41％(P＜0.05)位于腫瘤細胞。凋亡的內(nèi)皮細胞所處微血管的形態(tài)多無明顯管腔形成，呈點、條狀，幾乎無血流灌注;腫瘤的整體血流灌注量也明顯降低（對照組和治療組Hoechst33342的陽性百分比分別為18.72％±2.59％

14、和3.57％±0.83％，P＜0.001）。②硼替佐米誘導的凋亡與腫瘤微環(huán)境的初始乏氧程度、以及乏氧應答的抑制密切相關。對照組移植瘤內(nèi)幾乎無明顯凋亡;新生乏氧細胞群體(EF5“+”)的比例與初始乏氧細胞群體(Pimo“+”)的比例相似;EF5陽性細胞均有相應的乏氧應答下游產(chǎn)物CA9表達;但CA9的表達能力隨初始乏氧程度的加重而逐漸降低;微循環(huán)的血流也逐級下降。經(jīng)硼替佐米治療后，凋亡主要分布在中重度乏氧區(qū)域，cleaved caspase

15、3陽性百分比分別為7.54％±1.31％和7.92％±1.12％，腫瘤細胞和血管內(nèi)皮細胞均可見明顯的凋亡信號，且該區(qū)域的乏氧程度明顯增加，新舊乏氧腫瘤細胞的保護性乏氧應答產(chǎn)物CA9表達均明顯受抑;而在輕度乏氧區(qū)域，cleaved caspase3陽性百分比僅為1.08％±0.32％(P＜0.001)，僅點、條狀分布的細小血管見凋亡信號，中間大部分腫瘤細胞均無凋亡啟動，腫瘤的乏氧程度無明顯增加（無明顯的EF5染色），而CA9的表達亦無明顯

16、的受損。3) DCE MRI顯像能夠有效監(jiān)測硼替佐米治療后移植瘤微循環(huán)的動態(tài)變化。硼替佐米單劑量治療組，腫瘤平均血流量給藥后24小時顯著降低（以中央部為著），48小時恢復至治療前水平;腫瘤平均血流(Akep中位值)治療前、治療后24小時和48小時分別為0.072±0.017、0.018±0.010(P＜0.05)和0.068±0.018/min;雙劑量治療組，腫瘤平均血流量進行性下降，24小時以中央部血流降低為主，48小時中央部和周邊部

17、血流均顯著降低。腫瘤平均血流(Akep中位值)治療前、治療后24小時和48小時分別為0.072±0.017、0.037±0.013和0.022±0.010/min（P＜0.05）。4）離體實驗證實DCE MRI顯像能夠間接反映硼替佐米的抗腫瘤生物學效應。血流示蹤劑Hoechst33342的分布與末次DCE MRI顯像的Akep偽彩圖對微循環(huán)血流的顯示相似:對照組Akep偽彩圖和Hoechst33342顯微鏡圖像均顯示腫瘤的周邊和中央均有

18、一定的微循環(huán)血流分布;單次給藥后48小時，Akep偽彩圖和Hoechst33342顯微鏡圖像均顯示腫瘤內(nèi)的血流分布與對照組相似，腫瘤的周邊和中央均見微循環(huán)血流灌注，說明此時硼替佐米對腫瘤血流的影響已降低/消失;連續(xù)給藥后，兩種影像均顯示僅腫瘤的周邊區(qū)域有少量微循環(huán)血流，中央部幾乎無血流灌注，說明隨著硼替佐米的連續(xù)治療，腫瘤血流持續(xù)降低。硼替佐米治療后腫瘤微循環(huán)的動態(tài)變化與其對乏氧應答抑制的動態(tài)變化方向一致:單次給藥后48小時，隨著腫瘤微

19、循環(huán)的改善，CA9的表達亦恢復，接近對照組水平;連續(xù)給藥后腫瘤內(nèi)的血流灌注進行性降低，CA9的表達亦持續(xù)受抑。
　　 [結(jié)論]:腫瘤微環(huán)境的初始乏氧程度在硼替佐米抗腫瘤中起決定性作用。乏氧的血管內(nèi)皮細胞和腫瘤細胞是硼替佐米誘導凋亡的主要群體，并與硼替佐米阻斷乏氧應答密切相關。血管結(jié)構不良、處于中重度乏氧狀態(tài)的腫瘤血管內(nèi)皮細胞對硼替佐米更為敏感，易于凋亡，并導致局部微血管關閉、血流降低、進一步加重腫瘤乏氧。DCE MRI能夠有效監(jiān)