疫霉激發(fā)子的分離純化和激發(fā)素基因的克隆與表達.pdf

1、能與植物原生質(zhì)膜上高度特異的蛋白受體結(jié)合從而誘導(dǎo)植物產(chǎn)生防衛(wèi)反應(yīng)的分子統(tǒng)稱激發(fā)子，其中從一些真菌菌絲細(xì)胞壁或培養(yǎng)濾液中提取的激發(fā)子尤其受關(guān)注。真菌激發(fā)子可被用于研究植物過敏反應(yīng)的機理，其編碼基因有可能被用于轉(zhuǎn)基因操作從而獲得具有抗病性能的植物材料。本論文以一分離自長春花葉片的疫霉為材料，開展了激發(fā)子的蛋白純化，基因分離和原核表達等研究，主要研究結(jié)果如下： 1.從疫霉培養(yǎng)液中通過沸水浴、硫酸銨沉淀、非變性電泳、割膠電洗脫等純化步驟

2、，分離得到一種分子量約為31kD的耐高溫的胞外分泌型蛋白。此蛋白在低濃度下能引起煙草葉片發(fā)生過敏反應(yīng)；處理煙草懸浮細(xì)胞12hr后有44.6％的細(xì)胞死亡，24hr后有96.1％的細(xì)胞死亡，表明此蛋白具有激發(fā)子活性。此蛋白的N-端氨基酸序列與一些已報道的疫霉激發(fā)子高度同源，但其分子量與已報道的疫霉激發(fā)子有明顯差異，有可能是一種新的疫霉激發(fā)子。 2.真菌核糖體RNA編碼基因的ITS(internaltranscribedspacer)

3、序列在種內(nèi)保守性強，但在種間變異豐富，被廣泛用于親緣關(guān)系較近的分類群的系統(tǒng)發(fā)育研究。本實驗利用rDNA-ITS序列對所用疫霉進行分子鑒定，序列同源性比對結(jié)果顯示其rDNA-ITS序列與煙草疫霉的同源性高達99％以上，據(jù)此推測所用疫霉可能屬于煙草疫霉。 3.以已知的Phytophthoranicotiana激發(fā)素編碼基因序列設(shè)計引物，以本文所用疫霉的RNA為模板，通過RT-PCR獲得了激發(fā)素編碼基因，同時獲得了一個第63和223堿

4、基發(fā)生了突變的序列，此突變體的第63堿基G突變?yōu)锳，但編碼的第21位氨基酸未變，仍是絲氨酸；然而第223堿基由A突變成G則導(dǎo)致第75位氨基酸由蘇氨酸變成了丙氨酸。第75位氨基酸在激發(fā)素誘導(dǎo)煙草過敏反應(yīng)中的作用還未見報道。將此激發(fā)素基因及其突變體分別轉(zhuǎn)入pGEX-4T-1原核表達載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)都能產(chǎn)生特異產(chǎn)物，表達產(chǎn)物的分子量均為36kD，恰好是激發(fā)素與GST分子量之和，表明兩種表達產(chǎn)物是融合蛋白。這兩種融合蛋白在低濃