疫霉菌激發(fā)子PB90誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制研究.pdf

1、　　激發(fā)子PB90是疫霉菌分泌的一種分子量為90kD的胞外蛋白激發(fā)子，該激發(fā)子可以誘發(fā)非寄主植物煙草的過(guò)敏反應(yīng)和系統(tǒng)獲得抗性。本文在闡明該激發(fā)子誘發(fā)的煙草細(xì)胞過(guò)敏性死亡是一種細(xì)胞凋亡的基礎(chǔ)上進(jìn)一步就其分子機(jī)制進(jìn)行了研究?！　Y-2煙草懸浮細(xì)胞經(jīng)激發(fā)子PB90處理后，Trypanblue染色觀察到細(xì)胞死亡，這種死亡可被蛋白質(zhì)合成抑制劑Cycloheximide抑制，表明這種細(xì)胞死亡是主動(dòng)死亡過(guò)程。提取PB90處理的懸浮細(xì)胞的DNA進(jìn)行

2、瓊脂糖凝膠電泳觀察到DNAladder現(xiàn)象，表明核小體間的DNA發(fā)生了斷裂；對(duì)經(jīng)PB90分別處理4、12h的煙草懸浮細(xì)胞進(jìn)行TUNEL染色，觀察到較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào)，進(jìn)一步表明其細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生了DNA末端斷裂；同時(shí)結(jié)合DAPI染色觀察到經(jīng)PB90處理后的細(xì)胞染色質(zhì)凝集、細(xì)胞核解體形成凋亡小體等細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征。上述結(jié)果表明激發(fā)子PB90可以誘導(dǎo)BY-2煙草懸浮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡，提示該激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏反應(yīng)是一個(gè)細(xì)胞凋亡過(guò)程?！　煵輵腋〖?xì)

3、胞經(jīng)1nmol/LPB90處理后，煙草胞內(nèi)發(fā)生了NO的進(jìn)發(fā)，激發(fā)子PB90處理8h內(nèi)，出現(xiàn)兩個(gè)峰值；PB90處理后，煙草懸浮細(xì)胞胞外培養(yǎng)液pH值明顯升高；胞內(nèi)Redox平衡狀態(tài)發(fā)生改變。表明激發(fā)子誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞凋亡可能與動(dòng)物細(xì)胞凋亡具有相類似的機(jī)制。此外，表明PB90誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡的過(guò)程中伴隨著防衛(wèi)反應(yīng)的激活。進(jìn)一步利用抑制劑法進(jìn)行研究，結(jié)果顯示Ca2+螯合劑EGTA(5mmol/L)、Ca2+通道抑制劑LaCl3(0.1mmol/L

4、)、NO合酶(NOS)抑制劑L-NAME(0.2mmol/L)、NADPH氧化酶抑制劑DPI(10μmol/L)和蛋白質(zhì)合成抑制劑Cycloheximide(CHX，0.4mmol/L)可不同程度地抑制PB90誘導(dǎo)的煙草胞內(nèi)Redox平衡狀態(tài)的改變，TBI基因及PR1a、PR1b、PR1c基因的表達(dá)，也可不同程度地抑制PB90誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞凋亡，且隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制劑對(duì)PB90誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡的抑制率呈增加的趨勢(shì)(DPI除外)，表