蛋白質(zhì)激發(fā)子harpins誘導(dǎo)的植物信號通路及其交叉對話.pdf

1、本論文的研究目的：在前人研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步明確harpin誘導(dǎo)的各種效應(yīng)，解析相關(guān)的信號傳導(dǎo)機(jī)制，揭示乙烯和ABA在harpin誘導(dǎo)的促生長，抗病抗蟲過程中的交叉對話。 1、Harpins啟動植物信號傳導(dǎo)機(jī)制的初步解析 Harpins是由革蘭氏陰性植物病原細(xì)菌產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)激發(fā)子，他們共同的特征是：富含甘氨酸，熱穩(wěn)定，對蛋白酶敏感，注射非寄主植物葉片可誘導(dǎo)HR(hvpersensitive response)或HCD

2、(hypersensitive cell death)。外源施用lmrpins，可誘導(dǎo)植物的多種表型，如抗病、抗蟲、抗旱和促進(jìn)生長。作為一種多效型的激發(fā)子，它如何行使它的多重功能，目前還不清楚。本研究使用來自．Xanthomonas oryzae pv．oryzae的laarpinX<,oo>從信號傳導(dǎo)角度初步解析其產(chǎn)生機(jī)制。 首先，從煙草中克隆了三個受病原物誘導(dǎo)的啟動子PPP1、PPP2和PPP3，序列分析表明三者均含有受細(xì)菌

3、誘導(dǎo)的反應(yīng)元件，PPP1和PPP2還含有受生物激發(fā)子和SA誘導(dǎo)的反應(yīng)元件。通過替換35S啟動子將它們構(gòu)建于舍報告基因G?的植物轉(zhuǎn)化載體pB1121上，分別轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥，獲得了穩(wěn)定整合的轉(zhuǎn)基因植株。用青枯病菌(Ralstonia solanaceorum)接種轉(zhuǎn)基因植株，G?染色表明三個啟動子均可被誘導(dǎo)，說明克隆的啟動子具有活性。隨后，我們用sA、harpinx<,oo>及其三個具有不同功能的片段DEG(促進(jìn)生長)、DlR(誘導(dǎo)抗蟲)

4、、DPR(誘導(dǎo)抗病)噴霧處理轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)PPP1和PPP2均可被誘導(dǎo)，而PPP3不能，這與相關(guān)反應(yīng)元件的存在與否相一致。這說明，harpins在植物上的多重效應(yīng)可能是通過其特異性的功能域與PPPs中相應(yīng)的順式作用元件之間的相互作用來實現(xiàn)的，而且順式作用元件與harl)ins功能域之間的對話可能決定了laarpins起何種效應(yīng)。其次，我們將編碼llarpinxoo的基因hpaG<,Xoo>構(gòu)建于植物轉(zhuǎn)化載體pBI121上，并通過葉盤法

5、將其轉(zhuǎn)入煙草，獲得表達(dá)harpin<,Xoo>的轉(zhuǎn)基因株系(harpinxoo-eptessing tobacoo，HARTOB)。經(jīng)RT-PCR、Norethern雜交和SDS-PAGE電泳檢測，我們確定了laarpin<,Xoo>在轉(zhuǎn)基因煙草中的穩(wěn)定表達(dá)，并選擇表達(dá)水平分別為高、中和低的7號、6號、15號三個品系作為研究對象。用青枯菌(R．silanacearum)、煙草赤星菌(Alternariaalternata)和煙草花葉病毒

6、(TMV)分別接種這三個品系，發(fā)現(xiàn)均有抗性，并與harpin<,Xoo>的表達(dá)強(qiáng)度正相關(guān)。檢測抗病防衛(wèi)相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，SAR調(diào)控基因NPR1、防衛(wèi)基因GSR1、Chia5、PR-1a和PR-1b在不同的轉(zhuǎn)基因株系中均有不同程度的表達(dá)，其中在HARTOB7中表達(dá)最強(qiáng)，與抗病表型一致。觀察還發(fā)現(xiàn)所有HARTOB植株在整個生命周期都不自發(fā)macro-HR，也沒有檢測到micro-HR的發(fā)生和HCD標(biāo)志基因hsr203J和hinl的表達(dá)，這

7、與外用harpin<,Xoo>的效果剛好相反。根據(jù)上述結(jié)果，我們得出結(jié)論：harpinxoo轉(zhuǎn)入煙草中表達(dá)可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗病性，但不誘發(fā)HCD，與harpins外用的效果不同，這說明harpins誘導(dǎo)的HCD與抗病信號通路可能各行其道。 2、Harpins誘導(dǎo)植物促生長，抗蟲和抗旱的信號傳導(dǎo)解析 乙烯信號傳導(dǎo)可能調(diào)控了植物的生長和防衛(wèi)，并隨刺激的不同，參與的成分也可能不同。我們研究發(fā)現(xiàn)乙烯信號通路控制了harpin誘

8、導(dǎo)的抗蟲和促生長。用harpin溶液噴施野生型植株頂部或浸種處理擬南芥種子，都可導(dǎo)致促生長表型，其中后者表現(xiàn)為促進(jìn)根生長。同樣經(jīng)laarpin處理后的野生型植株對綠桃蚜(Myzus persicae)也具有了一定的抗性。 聯(lián)系SA、JA和乙烯三條激素信號通路研究發(fā)現(xiàn)，盡管SA可被lmrpin誘導(dǎo)，但它不引發(fā)抗蟲和促生長，因為laarpin可以誘導(dǎo)SA信號突變體促進(jìn)生長和抗蟲。內(nèi)源JA水平在laarpin處理后下降，JA信號傳導(dǎo)不

9、可缺少的基因COI1在處理后的植株中也沒有表達(dá)，而且harpin依然可以誘導(dǎo)JA抗性突變體．jar1-1抗蟲和促生長。乙烯水平在harpin誘導(dǎo)抗蟲和促生長過程中顯著升高，同時許多與乙烯信號傳導(dǎo)相關(guān)的基因也都有一定程度的表達(dá)。而且研究發(fā)現(xiàn)乙烯受體基因ETR1在這兩過程中是必需的，因為突變體etr1-1可取消這兩種效果。另外，用藥物抑制劑阻斷乙烯的感知也得到了相同的結(jié)果。EIN2和EIN5是乙烯信號通路下游的兩個重要分支，HrpN處理其突

10、變體ein2-1能誘發(fā)促生長但不能誘導(dǎo)抗蟲，而ein5-1能誘導(dǎo)抗蟲卻不能誘發(fā)促生長。綜上所述，我們認(rèn)為laarpin激活了乙烯信號通路，并通過下游的兩個分支EIN2和EIN5分別調(diào)控了擬南芥抗蟲和促生長。 HrpN不僅可誘導(dǎo)植物促生長、抗病和抗蟲，還可激活A(yù)BA信號通路引發(fā)缺水植-株的抗旱作用。外源施用HrpN，可促進(jìn)野生型擬南芥葉片氣孔關(guān)閉，降低葉片蒸騰速率，增加葉片持水量和脯氨酸含量，并可減輕因水分缺失引起的細(xì)胞膜損傷和干旱癥狀，

11、同時處理后植株內(nèi)源ABA含量上升，與ABA信號傳導(dǎo)相關(guān)的一些調(diào)控基因和效應(yīng)基因rd29B表達(dá)增強(qiáng)。ABA信號通路突變體abi1-1(ABI1磷酸酶缺陷型)經(jīng)HrpN處理后的抗旱反應(yīng)與野生型大致相當(dāng)，而突變體abi2-1(ABI2磷酸酶缺陷型)不能被HrpN誘發(fā)這些反應(yīng)。抑制野生型植株合成ABA可取消HrpN誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和干旱癥狀減輕。而且，HrpN處理abi2-1可誘導(dǎo)對Pseudomonas syringae的抗性，效果與野生型類似

12、。所以，依賴ABI2的ABA的信號通路調(diào)控了HrpN誘導(dǎo)的抗旱作用，但不影響植物的抗病性。 3、乙烯信號和ABA信號在harpins誘導(dǎo)的促生長，抗蟲和抗旱過程中的交叉對話 基于第二部分的研究結(jié)果，我們推測乙烯信號和ABA信號在harpins誘導(dǎo)的促生長/抗蟲和抗旱過程中可能存在交叉對話，所以我們對此開展了進(jìn)一步的研究。根據(jù)野生型上的藥物抑制實驗，和對乙烯信號突變體、ABA信號突變體的研究發(fā)現(xiàn)，這些過程涉及兩種激素信號的

13、協(xié)同和差別作用。用HrpN浸種處理野生型種子可促進(jìn)種子萌發(fā)和后續(xù)的根伸長生長，但這些效果可被乙烯突變體etr1-1，ABA突變體abi2-1和抑制野生型種子合成或感知乙烯和ABA所破壞。因此，這兩種激素信號在這些過程中都是需要的。當(dāng)用HrpN噴施擬南芥，植株生長被促進(jìn)，蚜蟲的繁殖數(shù)量也有所減少。用etr1-1和abi2-1，研究發(fā)現(xiàn)乙烯而不是ABA在促生長和抗蟲過程中是關(guān)鍵的，而且這一結(jié)果在野生型的藥物抑制實驗上也得到了驗證。當(dāng)擬南芥野