葫蘆巴堿誘導(dǎo)煙草Bright Yellow-2細(xì)胞凋亡及其分子機(jī)制研究.pdf

1、葫蘆巴堿(Trigonelline,TRG)是從豆科植物葫蘆巴(Trigonellafoenum-graecum L.)的干燥種子中分離的一種生物堿,它不僅存在于葫蘆巴屬植物,而且廣泛存在于其它植物中。葫蘆巴堿是尼克酸和尼克酰胺的代謝產(chǎn)物,與NADP+/ADPH和NAD+/NADH的代謝循環(huán)密切相關(guān)。在外界特殊環(huán)境下NADP+/NADP和NAD+/NADH積累過(guò)多后,其中一條代謝途徑就會(huì)引起葫蘆巴堿增加,葫蘆巴堿進(jìn)而作為信號(hào)分子作用于呼

2、吸鏈引起細(xì)胞凋亡。為了證明這種假說(shuō),本文以外源葫蘆巴堿為供試材料,以煙草Bright Yellow-2(BY-2)懸浮細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料,探討了葫蘆巴堿誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡的形態(tài)變化與生化特征,初步探索了細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制,得到以下幾方面的結(jié)果:
　　 1.煙草BY-2懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)受轉(zhuǎn)速、光照、溫度、培養(yǎng)液、傳代的體積比、傳代時(shí)間等因素的影響。研究發(fā)現(xiàn),振蕩培養(yǎng)的速度為130rpm、暗培養(yǎng)和25±2℃為最適合煙草BY-2懸浮細(xì)胞生長(zhǎng)的

3、條件。懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液采用MS改良后的培養(yǎng)液,另加2mg/L的2,4-D激素能為細(xì)胞生長(zhǎng)提供良好的營(yíng)養(yǎng)。細(xì)胞的傳代體積比為1:4,每隔7天傳代一次,可以保證細(xì)胞汲取新的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)以及避免大的細(xì)胞團(tuán)釋放有毒物質(zhì)對(duì)新生細(xì)胞毒害。通過(guò)對(duì)細(xì)胞鮮重、干重和FDA染色活力檢測(cè),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)在3-4天時(shí)處于對(duì)數(shù)期,此時(shí)的細(xì)胞最穩(wěn)定、活性強(qiáng)可以用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。
　　 2.TRG誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞死亡表現(xiàn)為細(xì)胞凋亡的典型特征。20mmol/LTRG可誘

4、導(dǎo)煙草BY-2細(xì)胞凋亡,處理72小時(shí)后Trypan blue染色,可觀察到細(xì)胞膜皺縮與細(xì)胞壁間有空隙,類似于質(zhì)壁分離的現(xiàn)象,細(xì)胞核凝集甚至細(xì)胞器不完整。Hoechst33258/PI雙染色經(jīng)熒光顯微鏡檢測(cè)觀察到細(xì)胞核染色質(zhì)固縮,邊緣化,空泡化。處理108小時(shí)提取其基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,觀察到DNA Ladder現(xiàn)象,表明DNA在核小體間發(fā)生斷裂;TUNEL檢測(cè)可觀察到較強(qiáng)的陽(yáng)性信號(hào),進(jìn)一步表明其細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生了DNA3'-OH末

5、端斷裂;TUNEL/Hoechst33258雙染觀察到與Hoechst33258/PI雙染相同的形態(tài)學(xué)特征。以上結(jié)果表明TRG可以誘導(dǎo)BY-2煙草懸浮細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞程序性死亡。
　　 3.探討了TRG誘導(dǎo)煙草細(xì)胞凋亡的機(jī)制。經(jīng)TRG處理后煙草細(xì)胞內(nèi)發(fā)生了活性氧進(jìn)發(fā),TRG處理8小時(shí)內(nèi),胞內(nèi)的H2O2出現(xiàn)兩個(gè)峰值,第一個(gè)峰值出現(xiàn)在處理后0.25h,第二個(gè)峰值出現(xiàn)在處理后6小時(shí),且第二個(gè)峰值大于第一個(gè)峰值;TRG處理后檢測(cè)到胞外的H2

6、O2也分別在0.25小時(shí)和1小時(shí)達(dá)到積累的高峰,而后H2O2達(dá)到了相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài);另外,在TRG處理誘導(dǎo)活性氧(ROS)的積累動(dòng)態(tài)變化過(guò)程中發(fā)現(xiàn),TRG處理12小時(shí)后檢測(cè)ROS的進(jìn)發(fā)量最高,此后直到120小時(shí)ROS的含量相對(duì)穩(wěn)定,說(shuō)明在煙草細(xì)胞凋亡過(guò)程中H2O2和ROS都參加了細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑;與此同時(shí)在TRG誘導(dǎo)了煙草細(xì)胞凋亡過(guò)程中30分鐘內(nèi)就檢測(cè)到NO的產(chǎn)生,到2.5小時(shí)時(shí)發(fā)生了NO進(jìn)發(fā),在6小時(shí)時(shí)檢測(cè)到得NO含量達(dá)到最大值,

7、此變化趨勢(shì)基本與H2O2相同,表明NO與H2O2協(xié)同作用促進(jìn)了細(xì)胞凋亡;為明確氧化反應(yīng)在煙草細(xì)胞死亡中的作用,進(jìn)一步用抗氧化劑抗壞血酸鹽((+)-Sodium L-ascorbate簡(jiǎn)稱AsA)對(duì)葫蘆巴堿誘導(dǎo)的煙草細(xì)胞凋亡進(jìn)行了分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)用AsA預(yù)處理后加入TRG,從AsA抑制TRG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡率的變化圖可以看出AsA對(duì)抑制17RG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有顯著效果。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)AsA抑制TRG誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的比率也相應(yīng)增加,由開始的抑制率6.