解淀粉芽孢桿菌NC6蛋白激發(fā)子PeBA1的分離鑒定及功能研究.pdf

1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）是植物根際生長促進菌中非常重要的一類生防菌。研究表明，芽孢桿菌生防機制主要包括：競爭、拮抗、誘導抗病性及促進生長等4個方面。目前尚未有關(guān)于解淀粉芽孢桿菌大分子蛋白激發(fā)子的報道，本研究首次從解淀粉芽孢桿菌 NC6菌株中分離純化出一種能夠誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病反應的新型蛋白激發(fā)子PeBA1，為進一步闡述解淀粉芽孢桿菌誘導抗病性提供一定的理論基礎(chǔ)。具體實驗內(nèi)容與結(jié)果如下：

2、r>　　1.蛋白激發(fā)子的分離純化及質(zhì)譜分析
　　通過硫酸銨沉淀，陰離子柱交換層析，以及活性膠回收等一系列蛋白純化方法，從解淀粉芽孢桿菌 NC6菌株中獲得一種能夠誘導煙草葉片產(chǎn)生典型過敏反應的蛋白質(zhì)激發(fā)子。并對該激發(fā)子進行質(zhì)譜分析，獲得其氨基酸序列，并命名為 PeBA1（ Protein elicitor from Bacillus amyloliquefaciens1）。
　　2.構(gòu)建PeBA1原核表達及純化系統(tǒng)
　　

3、克隆PeBA1基因，并將目的基因與原核表達載體E1連接，最后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞BL21(DE3)進行原核表達。進一步通過細胞超聲破碎，Ni柱親和層析，超濾除鹽濃縮獲得高濃度PeBA1重組蛋白。SDS-PAGE檢測及誘導煙草葉片過敏性壞死活性測試實驗驗證原核表達的準確性。
　　3.PeBA1的理化性質(zhì)及誘導煙草防御反應
　　進一步研究 PeBA1重組蛋白的理化性質(zhì)及誘導煙草防御反應。PeBA1重組蛋白能夠在4、25、50

4、、80、100℃水浴中孵育15min后保持良好的穩(wěn)定性。其所能夠引起枯斑三生煙煙草葉片過敏性壞死反應的最低濃度為5μM。PeBA1重組蛋白能夠誘導煙草防御早期事件如活性氧爆發(fā)（包括過氧化氫、超氧負離子的產(chǎn)生）。同時PeBA1重組蛋白可以誘導產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物，包括大量的酚類物質(zhì)形成等，其能夠增強細胞壁強度，阻止病原菌的侵染。
　　4.PeBA1誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性
　　通過誘導煙草抗病性測試，我們發(fā)現(xiàn) PeBA1重組蛋

5、白能夠誘導煙草產(chǎn)生對灰霉病菌和煙草花葉病毒的抗性。PeBA1重組蛋白處理的煙草葉片接種灰霉菌后，病斑直徑明顯小于蛋白緩沖液處理組，PeBA1處理的煙草葉片接種TMV后所引起病斑數(shù)和病斑大小均少于或小于緩沖液處理，證明 PeBA1重組蛋白能夠誘導煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，PeBA1重組蛋白處理煙草，能夠誘導水楊酸途徑相關(guān)抗病性基因如PR1a、PR1b和PR5和PAL，以及茉莉酸途徑相關(guān)部分抗病性基因如 COI1和 PDF1.2的