真菌蛋白激發(fā)子Hrip1誘導水稻抗病性及互作蛋白的鑒定.pdf

1、真菌蛋白激發(fā)子Hrip1是從極鏈格孢菌(Alternaria alternata)中分離得到的一種超敏反應誘導蛋白，分子量為17.6KD。Hrip1誘導煙草細胞壞死、介質堿化、鈣離子流動和ROS積累等一系列防御反應，并且提高煙草對TMV的系統(tǒng)抗性。為了進一步研究Hrip1蛋白在水稻上的功能，明確Hrip1誘導水稻產生防御反應的機制。本研究在畢赤酵母細胞中表達蛋白激發(fā)子Hrip1，并研究Hrip1誘導水稻抗稻瘟病的作用;通過酵母雙雜交技術

2、篩選Hrip1在水稻中的互作蛋白，同時利用GST pull down進一步證明了二者的相互作用;為了研究互作蛋白的功能，利用CRISPR/Cas9介導的基因編輯技術得到了互作蛋白基因敲除的水稻突變株。獲得了以下研究成果:
　　1、成功進行了Hrip1的真核細胞表達
　　成功構建了畢赤酵母重組表達載體pPICZαA-Hrip1，轉化畢赤酵母，通過Zeoc in濃度梯度篩選獲得了正確的酵母轉化子。通過甲醇誘導表達和親和層析純化得

3、到了純化的重組蛋白。Westernblot檢測證明了表達該蛋白為Hrip1。重組蛋白Hrip1具有天然Hrip1蛋白的活性，可以引起草葉片過敏性壞死反應，最低作用濃度為10μM。
　　2、Hrip1誘導水稻的抗病性反應
　　用濃度為30μM的Hrip1處理水稻，48小時后噴霧接種稻瘟菌孢子懸浮液，結果表明Hrip1能夠明顯提高水稻對稻瘟菌的抗性，水稻細胞內源水楊酸含量升高，并在48小時達到最高值;防御反應相關酶PAL、POD

4、、CAT活性也顯著提高。這些結果表明，Hrip1可以誘導水稻的防御反應，可能通過水楊酸途徑激活了水稻對稻瘟菌的抗性。
　　3、篩選獲得了Hrip1水稻互作蛋白
　　為了探究Hrip1誘導水稻產生抗病性的機制，通過酵母雙雜交實驗，成功在水稻cDNA文庫中篩選到一個Hrip1互作蛋白，命名為Hrip1-BP。Hrip1-BP在擬南芥中的同源蛋白為CSN5，是一個類泛素蛋白，在植物與病原物的互作中發(fā)揮重要作用。
　　4、體外

5、驗證了Hrip1與水稻中互作蛋白的特異性
　　根據(jù)水稻庫中Hrip1-BP的序列信息，設計特異引物，得到了Hrip1-BP的全長表達序列。通過構建pGEX-6p-2-Hrip1-BP重組載體，轉化大腸桿菌表達菌株BL21，成功得到了可溶性Hrip1-BP重組蛋白。用GST pull down技術驗證了Hrip1-BP能夠與Hrip1相互作用。
　　5、獲得了敲除互作蛋白基因水稻突變體
　　為了進一步闡明Hrip1-BP