交鏈孢菌激活蛋白激發(fā)水稻的應(yīng)答基因與抗病性分析.pdf

1、本研究選用從交鏈孢菌(Alternariaspp.)中分離純化出具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高植物抗病防蟲(chóng)性能的蛋白激發(fā)子，就其誘導(dǎo)抗性的作用機(jī)理及差異表達(dá)基因進(jìn)行了系列研究： 1)檢測(cè)了交鏈孢菌激活蛋白在誘發(fā)水稻幼苗對(duì)稻瘟菌抗性中的作用，測(cè)定抗性形成過(guò)程中兩種重要的活性氧H2O2和O2.-含量及抗病防御相關(guān)酶活性的變化，并測(cè)定交鏈孢菌激活蛋白對(duì)水稻抗病信號(hào)途徑關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平的影響。結(jié)果表明，水稻幼苗經(jīng)2μgml-1激活蛋白噴霧處理后

2、，5d后葉片的稻瘟菌病情指數(shù)和平均每葉病斑數(shù)開(kāi)始顯著降低，14d時(shí)對(duì)稻瘟菌的誘抗效果最為明顯。在激活蛋白處理后的前5dH2O2含量快速上升，7d后明顯下降。O2.-含量的變化趨勢(shì)與H2O2含量的變化相似，表現(xiàn)出先升后降的時(shí)序變化趨勢(shì)?？共》烙嚓P(guān)酶PAL、β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性提高，分別于處理后第7、5、9d活性達(dá)到高峰。2μg·ml-1交鏈孢菌激活蛋白處理1d后使水稻幼苗抗病相關(guān)基因NPR1和EIN2轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，3d后使

3、CTR1的轉(zhuǎn)錄受到抑制，但不影響PR4的轉(zhuǎn)錄。暗示SA和Et兩種信號(hào)分子協(xié)同參與了交鏈孢菌激活蛋白誘導(dǎo)水稻幼苗對(duì)稻瘟菌的抗性過(guò)程。 2)從水稻cDNA文庫(kù)中隨機(jī)挑取10000個(gè)基因，采用cDNA芯片鑒定交鏈孢菌激活蛋白引起水稻幼苗基因表達(dá)的變化，半定量RT-PCR和Northern雜交對(duì)10個(gè)表達(dá)增強(qiáng)的抗病防御和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因表達(dá)進(jìn)行了驗(yàn)證。2μgml-1激發(fā)子處理5d后，136個(gè)基因的表達(dá)顯著增強(qiáng)，93個(gè)基因的表達(dá)明顯受到抑

4、制。此229個(gè)差異表達(dá)基因中，15個(gè)基因可能參與了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，13個(gè)基因參與了抗病防御過(guò)程，117個(gè)基因是功能不明的新基因，另外的基因則分別參與了轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞生長(zhǎng)與分裂、細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)合成、加工與儲(chǔ)藏、基礎(chǔ)代謝、次級(jí)代謝和能量利用等過(guò)程。其中交鏈孢菌激活蛋白誘導(dǎo)了細(xì)胞色素P450、調(diào)節(jié)蛋白NPR1、抗壞血酸過(guò)氧化物酶、sgt1轉(zhuǎn)錄因子、bZIP轉(zhuǎn)錄因子、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸磷酸酶、胞質(zhì)磷酸二脂酶、硫代硫酸硫轉(zhuǎn)移酶

5、等參與抗病防御和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因的表達(dá)。半定量RT-PCR對(duì)10個(gè)表達(dá)增強(qiáng)的抗病防御和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因(依次命名為OsAiDG1-10)表達(dá)進(jìn)行的驗(yàn)證表明，除一個(gè)基因表達(dá)與對(duì)照差異不顯著和一個(gè)基因的表達(dá)受抑制外，其余均與cDNA芯片結(jié)果相符。Northernblotting分析驗(yàn)證兩個(gè)差異表達(dá)基因OsAiDG3和OsAiDG4的表達(dá)模式，結(jié)果表現(xiàn)出與cDNA芯片和PCR結(jié)果良好的一致性。 3)采用RT-PCR從水稻葉片cDNA中擴(kuò)

6、增到ORF為1263bp、1530bp的OsAiDG3和OsAiDG4基因。其中，OsAiDG3編碼420aa，分子量為47.2kDa，pI為5.02的蛋白，與許多已知CDPK具有較高同源性。OsAiDG4編碼509aa，分子量為57.1kDa，pI為7.74的蛋白，與許多已知RLK具有較高同源性。將OsAiDG3和OsAiDG4構(gòu)建到原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566宿主菌，經(jīng)0.5mmolL-1IPTG誘導(dǎo)4

7、h后，SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)分別于73kDa和83kDa位置出現(xiàn)特異性蛋白質(zhì)條帶，表明實(shí)現(xiàn)了目標(biāo)融合蛋白質(zhì)的高效表達(dá)。 4)為了了解差異表達(dá)基因OsAiDG3和OsAiDG4在抗病性中的作用，我們研究了抗病性不同的水稻品種中兩個(gè)基因?qū)绘滄呔せ畹鞍醉憫?yīng)的差異，并分別獲得轉(zhuǎn)OsAiDG3和OsAiDG4基因煙草，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因煙草植株中防御相關(guān)基因CHI的表達(dá)和煙草葉片對(duì)TMV的抗性。Northern雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1312(稻瘟病

8、抗性品系)和原豐早(稻瘟病敏感品系)中OsAiDG4的表達(dá)豐度均較高，OsAiDG3的表達(dá)豐度相對(duì)較低，交鏈孢菌激活蛋白處理明顯誘導(dǎo)了抗性品系中兩個(gè)基因的表達(dá)，而敏感品系基因的表達(dá)影響不大，推測(cè)不同品種間蛋白激酶對(duì)激發(fā)子響應(yīng)的差異可能是決定不同品種稻瘟菌抗性差異的原因之一。將OsAiDG3和OsAiDG4分別構(gòu)建到植物表達(dá)載體PBI121上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化煙草葉盤(pán)，PCR檢測(cè)顯示成功獲得轉(zhuǎn)OsAiDG3和OsAiDG4基因煙