用轉(zhuǎn)基因方法構(gòu)筑水稻稻瘟病抗病性.pdf

1、稻瘟病是水稻最嚴(yán)重的病害之一，與白葉枯和紋枯病一起被列為水稻三大主要病害。目前水稻中已克隆的抗稻瘟病基因大多數(shù)都為NBS-LRR類，且部分是復(fù)等位基因，這些基因多數(shù)抗譜較窄，而稻瘟病菌生理小種變異快，使其容易逃脫抗性基因的識別，導(dǎo)致抗性喪失，使這些抗性基因的應(yīng)用受到限制。因此，尋找廣譜持久的抗性資源及利用異源抗病基因是水稻抗稻瘟病研究的重要探索方向。本研究旨在通過非直接的抗稻瘟病基因作為切入點，尋求構(gòu)筑抗稻瘟病的新策略。為此，我們用轉(zhuǎn)基

2、因方法，在水稻中分別表達(dá)異源抗病基因RPW8.1和RPW8.2、針對稻瘟病菌關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子MoAP1的小干涉RNA以及miR160a和miR398b兩個小RNA，均成功獲得了對稻瘟病具有抗病性的轉(zhuǎn)基因系?，F(xiàn)分述如下。
　　RPW8是從擬南芥MS-0中通過圖位克隆法獲得的抗病基因位點，該位點包含兩個緊密連鎖的基因:RPW8.1和RPW8.2，它們均對白粉病具有廣譜抗病性。在白粉病侵染擬南芥時，RPW8.2會在吸器周圍富集形成吸器復(fù)合體

3、鞘(EHC)而保護(hù)宿主細(xì)胞。RPW8.1抗擊白粉菌的機制尚不清楚，但表達(dá)RPW8.1的擬南芥轉(zhuǎn)基因系能抗白粉病和霜霉病。本項目想研究異源抗病基因?qū)Φ疚敛〉目剐?，為此將RPW8.1和RPW8.2導(dǎo)入水稻中，觀察轉(zhuǎn)基因水稻對稻瘟病的抗性影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，表達(dá)RPW8.1的水稻轉(zhuǎn)基因系對稻瘟病有抗性，不管是在采用活體貼菌還是在離體噴菌的抗性鑒定中，表達(dá)RPW8.1的水稻轉(zhuǎn)基因系形成的病斑都明顯小于對照，侵入菌絲的含量也低，并且相關(guān)防衛(wèi)基因PR1

4、0和PBZ1的表達(dá)量都提前升高。通過激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，非轉(zhuǎn)基因材料12小時就開始大量產(chǎn)生附著胞，隨后產(chǎn)生侵入菌絲。而在轉(zhuǎn)基因材料中雖然產(chǎn)生了少量附著胞，但在隨后的時間并未產(chǎn)生侵入菌絲。在采用活體貼菌的抗性鑒定中，表達(dá)RPW8.2的水稻轉(zhuǎn)基因系形成的病斑也明顯小于對照，表現(xiàn)出對稻瘟病菌的抗性。這些結(jié)果表明，將RPW8.1和RPW8.2導(dǎo)入水稻中能增強水稻對稻瘟病的抗性;也說明利用異源抗病基因構(gòu)筑稻瘟病抗病性是可行的。
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5、iRNA在調(diào)節(jié)植物生長和防御方面是不可或缺的，在水稻對稻瘟病的免疫方面還未有相關(guān)的報道。通過對比對稻瘟病的感病與抗病材料，鑒定出抗性材料中特異上調(diào)的miRNAs，選取其中miR160a和miR398b進(jìn)行轉(zhuǎn)基因過量表達(dá)，并獲得了3株過量表達(dá)miR160a和8株過量表達(dá)miR398b的轉(zhuǎn)基因系。對轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行噴菌實驗研究表明其能增強水稻對稻瘟病的抗性。
　　RNAi是一種由雙鏈RNA誘發(fā)的基因沉默現(xiàn)象，利用RNAi技術(shù)可以將稻瘟病菌

6、侵染水稻所需的關(guān)鍵基因沉默，這樣就能達(dá)到控制稻瘟病菌侵染的目的。MoAP1是一個稻瘟病菌致病相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在稻瘟病菌侵染水稻時不可或缺。該基因在分生孢子和侵入菌絲中能高表達(dá)，其突變體對稻瘟病菌的生長及侵染能力都表現(xiàn)出缺陷。設(shè)計針對Mo AP1的小干涉RNA(siRNA)，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)導(dǎo)入水稻，利用寄主誘導(dǎo)的基因沉默，在稻瘟病菌侵染水稻時將MoAP1沉默掉，從而表現(xiàn)為抗病。本研究獲得了能沉默MoAP1的siRNA轉(zhuǎn)基因系，部分轉(zhuǎn)基因系