補骨脂抗菌蛋白PscAFP的酵母表達及轉(zhuǎn)基因煙草抗病性分析.pdf

1、自人類有栽培活動以來植物病害就是制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的一大因素。植物病害造成糧食大量減產(chǎn)的同時還影響農(nóng)產(chǎn)品的品質(zhì)。化學防治是目前農(nóng)業(yè)上最主要且應(yīng)用面積最大的防治措施。雖然化學防治具有方便、快速、適用面積大等優(yōu)點，但也存在諸多的不足之處，如有害生物隨化學農(nóng)藥的施用產(chǎn)生抗藥性，導致化學農(nóng)藥的防治效果下降；在殺死有害生物的同時也殺死有益生物，破壞生態(tài)平衡，導致有害生物猖獗。然而，傳統(tǒng)育種手段在選育抗病害新品種上耗時費力，遠不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的需求。通

2、過遺傳轉(zhuǎn)化的手段將某些抗病基因或抗菌蛋白基因轉(zhuǎn)化到植物中，可以很好的提高植物抗病性。目前抗菌蛋白的抗病機理有幾種解釋，但具體機制仍不是很清楚。
　　 本研究以中藥材補骨脂為材料，在前期工作中分離到一個具有胰蛋白酶抑制劑活性的抗菌蛋白。在克隆到編碼該蛋白的基因PscAFP后，將其在畢赤酵母中表達并初步測定了蛋白PscAFP活性，同時將基因PscAFP轉(zhuǎn)化到美國煙草中，對轉(zhuǎn)基因煙草進行了抗病性檢測。結(jié)果證明轉(zhuǎn)基因PscAFP的煙草抗

3、病能力與野生型相比明顯的增強。上述實驗的主要結(jié)果有：
　　 1.將編碼成熟的PscAFP蛋白的基因插入到巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)表達載體pPIC9K中；重組質(zhì)粒pPIC9K-PscAFP經(jīng)線性化后，用電轉(zhuǎn)化法導入畢赤酵母(P.pastoris)菌株GS115(his-/mut+)中。轉(zhuǎn)化子用含1.75 mg/mL G418的YPD平板篩選獲得多拷貝Mut+轉(zhuǎn)化子。最后，1％甲醇誘導表達出分子量約為20KD

4、a的PscAFP蛋白。以重組PscAFP蛋白作抗原免疫家兔獲得滴度達到1:512000的多克隆抗體10.9ml(濃度為0.635mg/ml)；同時，酵母表達產(chǎn)物PscAFP對煙草赤星病菌孢子萌發(fā)有明顯的抑制作用。
　　 2.以Phe.Val.Arg.PNA，Boc.Gly.Pro.PNA，BNPNA為胰蛋白酶水解底物表明：重組蛋白PscAFP對胰蛋白酶活性有明顯的抑制作用，其抑制活力分別為15.83、11.06、1.43nmol

5、/s/ml，而胰蛋白酶不能降解BANA，其抑制活力也就為0。
　　 3.成功構(gòu)建植物表達載體Ps-PscAFP，通過根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導對煙草外植體進行遺傳轉(zhuǎn)化并獲得了轉(zhuǎn)基因再生植株。通過對轉(zhuǎn)基因再生植株離體葉片接種煙草赤星病菌(Alternaria alternata)的實驗篩選得到了抗病能力比野生型有明顯提升的轉(zhuǎn)基因株系。通過轉(zhuǎn)基因煙草活體接種煙草青枯病菌(Ralstonia