蛋白激發(fā)子PevD1互作蛋白Nbnrp1在煙草抗病性中的作用.pdf

1、PevD1是本實(shí)驗(yàn)室從大麗輪枝菌(Verticillium dahliae)發(fā)酵液中分離純化的一種新蛋白激發(fā)子，能引起煙草類似HR的細(xì)胞壞死反應(yīng)，并誘導(dǎo)煙草產(chǎn)生系統(tǒng)抗病性，但是煙草如何識別PevD1而激發(fā)煙草抗病反應(yīng)的作用機(jī)理尚不清楚。作者實(shí)驗(yàn)室前期利用酵母雙雜交和雙分子熒光標(biāo)記技術(shù)在煙草細(xì)胞中鑒定了一個(gè)PevD1的互作蛋白Nbnrp1。本研究在前期基礎(chǔ)上，用酵母雙雜交和GST Pull-down技術(shù)進(jìn)一步確定Nbnrp1與PevD1結(jié)

2、合的功能結(jié)構(gòu)域；熒光觀察Nbnrp1和PevD1在煙草細(xì)胞中的共定位；通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了Nbnrp1過表達(dá)本生煙植株和Nbnrp1沉默本生煙植株；通過比較兩種轉(zhuǎn)基因本生煙與野生型本生煙對 PevD1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死和抗病性的變化，明確Nbnrp1參與了蛋白激發(fā)子PevD1誘導(dǎo)的抗病性。為進(jìn)一步探索蛋白激發(fā)子PevD1誘導(dǎo)煙草抗性信號傳導(dǎo)途徑提供科學(xué)依據(jù)。
　　本研究獲得的主要研究結(jié)果如下：
　　1、確定了Nbnrp1與Pev

3、D1互作的功能結(jié)構(gòu)域
　　生物信息學(xué)分析顯示Nbnrp1含有DCD結(jié)構(gòu)域，據(jù)此，構(gòu)建pGADT7-Nbnrp1△N（DCD結(jié)構(gòu)域）和pGADT7-Nbnrp1△C重組載體，并分別與pGBKT7-PevD1轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中，檢測發(fā)現(xiàn)僅Nbnrp1△N即DCD結(jié)構(gòu)域與PevD1特異性結(jié)合。
　　為了進(jìn)一步明確Nbnrp1的DCD結(jié)構(gòu)域與PevD1互作，用GST pull-down技術(shù)進(jìn)行了互作驗(yàn)證。首先構(gòu)建原核表達(dá)載體pGEX-

4、6P-2-Nbnrp1△N，用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得了可溶性的重組表達(dá)蛋白；經(jīng)GST親和層析技術(shù)和陰離子交換層析技術(shù)純化表達(dá)蛋白，得到了GST-Nbnrp1△N的單一蛋白條帶，表觀分子量約為41kDa。將 His-PevD1蛋白和 GST-Nbnrp1△N蛋白進(jìn)行 GST pull-down，SDS-PAGE分析顯示，GST-Nbnrp1△N蛋白能與His-PevD1蛋白在體外特異結(jié)合。進(jìn)一步確定了Nbnrp1的DCD結(jié)構(gòu)域是Nbnrp1

5、與PevD1結(jié)合的功能結(jié)構(gòu)域。
　　2、Nbnrp1蛋白與PevD1蛋白在煙草細(xì)胞中的共定位
　　構(gòu)建瞬時(shí)表達(dá)載體pYBA1132-Nbnrp1和pCAM1032-PevD1-RFP，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法在煙草中共表達(dá)。激光共聚焦顯微鏡下觀察到，帶綠色熒光的Nbnrp1與紅色熒光PevD1在煙草細(xì)胞中能夠重合并發(fā)出黃色熒光，表明Nbnrp1蛋白與PevD1能共定位在亞細(xì)胞器細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)。
　　3、Nbnrp1過表達(dá)本生煙

6、的獲得及基因功能的研究
　　構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-Nbnrp1，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法得到Nbnrp1過表達(dá)本生煙植株共137個(gè)株系；其中83株呈陽性。47株T1代轉(zhuǎn)基因煙草中，陽性植株為34株，陰性植株為13株，分化比例約為3：1。Southern Blot鑒定了陽性轉(zhuǎn)基因植株為單拷貝。與野生型植株相比，PevD1處理的Nbnrp1過表達(dá)煙草植株出現(xiàn)壞死斑的時(shí)間早，所需誘導(dǎo)濃度低，HR標(biāo)記基因HRS203J的轉(zhuǎn)錄表達(dá)

7、量上調(diào)；Nbnrp1過表達(dá)煙草植株對TMV的抑制率提高41.2％，對假單胞桿菌（Pseudomonas syringae pv. tabaci）的抑制率提高91.1%，并且抗病相關(guān)基因PR1-a和PR1-b也顯著上調(diào)表達(dá)。
　　4、Nbnrp1沉默本生煙的獲得及基因功能的研究
　　選取DCD結(jié)構(gòu)域所在的編碼序列作為干擾片段，采用RNAi的方法對本生煙Nbnrp1基因進(jìn)行沉默。構(gòu)建了中間載體 pRNAi1017-SA，將帶有內(nèi)

8、含子的正反向序列插入到植物過表達(dá)載體 pCAMBIA2300中，成功構(gòu)建了載體 pCAMBIA-RNAi-Nbnrp1。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法獲得Nbnrp1干擾植株共116個(gè)株系；PCR檢測56株呈陽性；37株T1代植株中，陽性植株為28株，陰性植株為9株，分化比例約為3：1。陽性植株的Nbnrp1基因沉默效率達(dá)80%以上。與野生型植株相比，PevD1處理后Nbnrp1沉默植株對PevD1誘導(dǎo)的細(xì)胞壞死敏感性降低，表現(xiàn)為壞死斑出現(xiàn)