三種激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡調(diào)控基因的篩選、克隆及功能研究.pdf

1、為了抵抗病原菌的侵染，植物進(jìn)化出一套可以抑制病原菌擴(kuò)展的防衛(wèi)機(jī)制，使之能識(shí)別特定的病原菌，并作出及時(shí)、有效的防衛(wèi)反應(yīng)。植物具有兩種層面的先天免疫系統(tǒng):第一種是基于細(xì)胞表面的模式識(shí)別受體對(duì)病原物相關(guān)分子模式的識(shí)別，即病程相關(guān)分子模式(Pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMP)，這種模式誘導(dǎo)的防衛(wèi)反應(yīng)稱(chēng)為PTI;第二種是植物細(xì)胞內(nèi)的R蛋白通過(guò)對(duì)病原菌釋放在寄主細(xì)胞內(nèi)的效應(yīng)分子的識(shí)別而觸發(fā)的免疫防衛(wèi)反

2、應(yīng)，稱(chēng)為效應(yīng)分子觸發(fā)的免疫反應(yīng)(Effector-triggeredimmunity，ETI)。PAMPs是一類(lèi)比較保守的微生物物質(zhì)，可以啟動(dòng)植物體級(jí)聯(lián)信號(hào)途徑，最終誘發(fā)植物的抗病性。本研究采用病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(Virus-inducedgenesilencing，VIGS)從本氏煙(Nicotianabenthamiana)cDNA文庫(kù)中篩選、克隆了參與三種激發(fā)子(Nep1、harpin和INF1)誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡(Hyper

3、sensitivecelldeath，HCD)的基因，并對(duì)其中一個(gè)參與調(diào)控harpin誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡的基因NbMADsl進(jìn)行機(jī)制研究。
　　本研究利用PVX病毒表達(dá)載體構(gòu)建了本氏煙cDNA文庫(kù)，通過(guò)農(nóng)桿菌Gv3101接種沉默煙草，從2500顆煙草中篩選到16個(gè)參與不同激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡的基因和3個(gè)沉默后影響煙草生長(zhǎng)的基因，通過(guò)在網(wǎng)站上比對(duì)，其中12個(gè)與已知基因有較高的同源性。其中編號(hào)為Nb2-37的基因編碼煙草中的M

4、ADs-box蛋白，我們從本氏煙中克隆了該基因的全長(zhǎng)cDNA，命名為NbMADsl，該基因的沉默可以減弱harpin誘導(dǎo)的HR;Nb34-22和Nb34-3兩個(gè)克隆分別編碼依賴(lài)于ATP的蛋白酶和UDP-D-木糖合酶，兩者沉默后均能使煙草矮化;克隆Nb16-5編碼ADP-核糖基化因子，該基因沉默后本氏煙死亡。上述結(jié)果表明，利用煙草cDNA文庫(kù)并采用VIGS技術(shù)沉默煙草并注射激發(fā)子，可篩選并克隆參與不同激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡的調(diào)控基因，

5、并為揭示激發(fā)子誘導(dǎo)的植物防衛(wèi)反應(yīng)分子機(jī)制提供試驗(yàn)依據(jù)。
　　從本氏煙cDNA文庫(kù)中篩選到一個(gè)調(diào)控激發(fā)子誘導(dǎo)的過(guò)敏性細(xì)胞死亡的基因NbMADS1，通過(guò)Nep1、harpin和INF1的注射發(fā)現(xiàn)該基因沉默能減弱harpin誘導(dǎo)的HCD，但不影響Nep1和INF1誘導(dǎo)的HCD。ⅣbMADsl基因沉默削弱了激發(fā)子harpin誘發(fā)的H2O2積累，抑制了harpin誘導(dǎo)的氣孔關(guān)閉和保衛(wèi)細(xì)胞中NO的積累，但是對(duì)激發(fā)子Nep1和INF1誘導(dǎo)的HR

6、、AOS、NO及氣孔關(guān)閉均沒(méi)有影響，這表明不同激發(fā)子誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉、NO和H2O2積累的機(jī)制存在差異。大量研究表明，MADs-box基因家族參與了植物花器官的分化和下游基因的調(diào)控，但至今沒(méi)有關(guān)于該基因家族是否參與植物防衛(wèi)反應(yīng)的報(bào)道。因此本研究對(duì)于探究harpin誘導(dǎo)的HR分子機(jī)制和MADs-box基因家族是否參與植物防衛(wèi)反應(yīng)具有重要意義。研究表明NbMADsl基因沉默削弱了激發(fā)子harpin誘發(fā)的H2O2積累，抑制了harpin誘導(dǎo)的氣孔