兒童過(guò)敏性紫癜的致病基因研究.pdf

1、目的：
　　探討過(guò)敏性紫癜（Henoch-Schonlein purpura，HSP）患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）中C1GALT1及Cosmc mRNA表達(dá)量與臨床的相關(guān)性以及HSP患兒是否存在Cosmc基因突變和突變與HSP發(fā)病的關(guān)聯(lián)性。此外，基于一對(duì)兒童期共患HSP的父子進(jìn)行全外顯子組測(cè)序分析，篩選出可能與HSP發(fā)病相關(guān)的致病基因，隨后在93例HSP患兒中

2、予以驗(yàn)證。
　　方法：
　　收集31例HSP患兒的外周血樣本和臨床資料，Trizol試劑提取PBMC中的RNA，加1ug RNA通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后利用RT-PCR法檢測(cè)PBMC中C1GALT1及Cosmc mRNA表達(dá)量。擴(kuò)大HSP樣本至84例，利用Trizol法提取PBMC中的DNA，并通過(guò)Touch down PCR對(duì)Cosmc基因的外顯子進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)對(duì)一對(duì)兒童期共患HSP的父子進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，篩選出可能

3、與HSP發(fā)病相關(guān)的基因，然后在93例HSP患兒中通過(guò)PCR的方法驗(yàn)證篩選出的基因是否存在突變。
　　結(jié)果：
　　正常對(duì)照組及非HSPN組和HSPN組的C1GALT1 mRNA2-ΔCt值分別為0.01716±0.00896、0.01392±0.00478、0.00999±0.00269，Cosmc mRNA2-ΔCt值分別為0.00319±0.00143、0.00266±0.00099、0.00241±0.00052；與對(duì)照

4、組相比，非HSPN組和HSPN組患者C1GALT1及Cosmc mRNA的表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)，HSPN更為明顯，但統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示無(wú)顯著性差異（p>0.05）。HSP患兒Cosmc基因存在兩個(gè)位點(diǎn)的突變，分別為c.393T>A和c.72 A>G；這2個(gè)突變位點(diǎn)的各基因型、等位基因頻率在 HSP與對(duì)照組中的分布無(wú)顯著性差異，在不同性別中亦如此。全基因組測(cè)序篩選出MIF基因和MGAT5基因可能與HSP的發(fā)病相關(guān)聯(lián)。93例HSP患兒中驗(yàn)證結(jié)果顯示M

5、IF基因存在3個(gè)錯(cuò)義突變，分別為c.282-6C>G、c.338C>CT和c.295T>C；MGAT5基因存在3個(gè)同義突變（c.142C>CT，c.348A>AG，c.267A>AG）和2個(gè)錯(cuò)義突變（c.1117A>AG，c.673C>G）。c.282-6C>G變異位點(diǎn)位于MIF基因剪接區(qū)且35例HSP患兒（37.6%）攜帶該突變位點(diǎn)，這與歐洲人群（32.2%）及東亞人群中（28.6%）的頻率相近，且該等位基因頻率>3%被認(rèn)為是SNP位

6、點(diǎn)，與HSP發(fā)病可能并無(wú)關(guān)聯(lián)。此外，2例出現(xiàn)c.338C>CT突變位點(diǎn)，1例出現(xiàn)c.295T>C突變位點(diǎn)。這2個(gè)位點(diǎn)在HSP中的突變率（2.15%、1.08%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于東亞人群及歐洲人群的比例且這3名患者臨床癥狀較為嚴(yán)重，需要足量激素或激素聯(lián)合免疫抑制劑治療，提示MIF基因突變可能與HSP的發(fā)病、疾病嚴(yán)重程度以及激素的治療劑量和激素抵抗有關(guān)。關(guān)于MGAT5基因，3個(gè)同義突變并不會(huì)引起氨基酸的改變，亦不會(huì)引起MGAT5蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化

7、，因此認(rèn)為與HSP發(fā)病無(wú)關(guān)聯(lián)。而c.1117A>AG，c.673C>G這2個(gè)突變位點(diǎn)各存在于1名HSP患兒中，其在HSP患者中的發(fā)病率（1.08%）遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于東亞及歐洲人群。發(fā)生這2個(gè)突變位點(diǎn)的HSP患兒臨床癥狀也較為嚴(yán)重，且激素治療時(shí)間長(zhǎng)，可提示MGAT5基因突變可能與HSP的疾病嚴(yán)重程度及激素用藥時(shí)間有關(guān)。
　　結(jié)論：
　　患兒外周血單個(gè)核細(xì)胞中C1GALT1及Cosmc mRNA的表達(dá)量可能與HSPN密切相關(guān)；HSP病人