CMY-39型AmpC酶的原核表達和特性研究.pdf

1、目的：對從臨床分離的弗勞地枸櫞酸桿菌（標本號90757）產生的CMY-39型AmpC酶蛋白進行藥物敏感試驗和酶特性研究。
　　方法：（1）對弗勞地枸櫞酸桿菌作頭孢西丁敏感試驗及三維試驗以檢測AmpC酶，提取菌株質粒進行CIT序列擴增并確定其基因分型。
　?。?）參照Genbank上的CMY-39型AmpC酶基因序列設計合成CMY-39基因的PCR引物，以90757號菌的總基因組作為模板，PCR擴增CMY-39的編碼基因，將C

2、MY-39的PCR產物純化后與pGEM-T載體連接，測定CMY-39的核苷酸序列。
　　（3）將CMY-39基因克隆到PET-32a(+)系統(tǒng)進行重組，重組質粒在大腸埃希菌BL21（DE3）中表達，SDS-PAGE電泳鑒定酶蛋白的表達。
　?。?）取CMY-39重組菌和原菌株進行藥物敏感試驗，提取重組菌的CMY-39蛋白進行三維試驗和Western blot檢測，并對此酶蛋白進行酶動力學檢測。
　　結果：（1）證實90

3、757號菌株為產CMY-39型AmpC酶的弗勞地枸櫞酸桿菌，序列分析結果顯示目的基因片段長1146bp，經GenBank同源性比較，目的基因的氨基酸序列與GenBank上登錄的CMY-39編碼基因同源性為99％，它是CMY-39的突變株，為新型的CMY基因型，GenBank登陸號為HM565135。
　?。?）成功構建PET32a(+)/CMY-39重組質粒，經 XhoⅠ和EcoRⅠ雙酶切后，得到大小為1146bp和5901bp左

4、右的片斷。
　?。?）SDS-PAGE電泳結果顯示，重組菌株經18℃誘導過夜后可見明顯特異性表達條帶，分子量約60KD。
　?。?）藥物敏感試驗顯示，CMY-39重組菌株保持了產CMY型酶菌株的耐藥特征，對第一、二代頭孢菌素和頭霉素類表現為耐藥，對第三、四代頭孢菌素，氨基糖苷類和碳青霉烯類表現為敏感，耐藥性不被β-內酰胺酶抑制劑，如他唑巴坦抑制。
　?。?）酶動力學數據顯示，重組酶測定的Km值與原菌株相比，均有不同程度