質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶共有抗原表位的預(yù)測(cè)及原核表達(dá).pdf

1、目的：應(yīng)用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶(pAmpcs)共有抗原表位，并實(shí)現(xiàn)pAmpCs共有抗原表位-Trx融合蛋白的原核表達(dá)、純化和鑒定。 方法：運(yùn)用多序列比較工具找出各型質(zhì)粒介導(dǎo)的AmpC β-內(nèi)酰胺酶的共有相對(duì)保守區(qū)域，并利用分子生物學(xué)軟件Biosun預(yù)測(cè)各亞型pAmpCs的可及性、抗原性、抗原表位、柔性、親水性等參數(shù)，通過(guò)綜合分析后找出其共有的抗原表位區(qū)域pAmpCs1。根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏好性，

2、把氨基酸序列pAmpCs1轉(zhuǎn)變?yōu)楹塑账嵝蛄衟ampcs1，采用重疊延伸PCR合成pampcs1片斷，并構(gòu)建原核表達(dá)載體pET32a(+)/pampcs1。通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，對(duì)含有該重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21(DE3)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析后，用Ni-NTA親和層析法純化pAmpCs1-Trx融合蛋白，利用western blotting方法鑒定融合蛋白的抗原性。 結(jié)果：根據(jù)預(yù)測(cè)結(jié)果找到了一段各型pAmpCs

3、共有的抗原表位區(qū)域pAmpCs1，成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET32a(+)/pampcs1，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后得到了分子量約為23KD的融合蛋白，經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化后，通過(guò)western blotting鑒定該蛋白能被抗AmpC β-lactamases多抗識(shí)別。 結(jié)論：成功構(gòu)建了pAmpCs1-Trx融合蛋白原核表達(dá)載體，并獲得了高純度的pAmpCs1-Trx融合蛋白，初步證明了其抗原性，為制備特異性抗體及建立快速檢