融合蛋白RGD-β-內(nèi)酰胺酶的重組表達及活性實驗.pdf

1、腫瘤的抗體導(dǎo)向酶—前藥療法(antibody-directedenzymeprodrugtherapy，ADEPT)是將單抗與酶制成偶聯(lián)物，注射到含有對應(yīng)抗原的腫瘤患者體內(nèi)，利用單抗將酶導(dǎo)入并駐留于腫瘤部位，經(jīng)過一段時間，待血液和其它組織中抗體-酶偶聯(lián)物廓清之后，給予無毒性的前藥，腫瘤部位的酶將前藥轉(zhuǎn)變?yōu)榛钚运幬铮瑲⑺滥[瘤細胞。
　　 ADEPT結(jié)合了單抗的靶向性和酶的高效性，同時能提供旁觀者效應(yīng)殺死單抗-酶偶聯(lián)物結(jié)合細胞周圍的

2、腫瘤細胞。ADEPT系統(tǒng)的設(shè)計包括抗體優(yōu)化，使其保留靶向性降低免疫原性；酶的選擇；偶聯(lián)物的構(gòu)建；前藥的設(shè)計，合成，優(yōu)化等方面。為了實現(xiàn)靶向性治療，單抗-酶偶聯(lián)物在生理條件下應(yīng)有活性，低免疫原性，最好不要選用人體內(nèi)源性的酶以避免前藥在正常組織被激活。
　　 單抗-酶偶聯(lián)物設(shè)計的重要前提是要保證抗體對抗原的結(jié)合能力和酶的催化活性。其偶聯(lián)的化學(xué)鍵應(yīng)穩(wěn)定，因為給予偶聯(lián)物和前藥之間有一定的時間間隔，需要等正常組織和血液中的偶聯(lián)物廓清，在這

3、段時間內(nèi)抗體-酶偶聯(lián)物之間不能斷裂。以保證其停留在腫瘤部位。
　　 ADEPT應(yīng)用的前藥為酶的底物與細胞毒性藥物的偶聯(lián)物，前藥本身無毒性或毒性很小，只有被酶激活，才會釋放原藥產(chǎn)生細胞毒性。由于腫瘤部位易滲漏，因此應(yīng)選擇半衰期短的原藥；烷化劑和核酸嵌合劑由于其與靶分子的結(jié)合多是不可逆的，半衰期短，且其代謝物無毒性較為適合做ADEPT系統(tǒng)的原藥。
　　 RGD4C(ACDCRGDCFCG)，是含有兩個二硫鍵的環(huán)形RGD多肽，

4、對腫瘤新生血管內(nèi)皮細胞的結(jié)合能力很強。在重組蛋白的研究中，有很多研究小組將RGD4C與腫瘤壞死因子、白細胞介素等大分子重組后得到新的靶向蛋白，具有很好的靶向性且不影響所連蛋白生物活性。RGD4C具有分子量小，特異性高的特點，比較適合作為ADEPT系統(tǒng)中的抗體部分。
　　 β-內(nèi)酰胺酶是一個單鏈蛋白，分子量相對較小，性質(zhì)穩(wěn)定且易于純化；其與單抗組成的融合蛋白，在血漿中的清除速度快，應(yīng)用于ADEPT時不需要使用清除抗體，可在注射融合

5、蛋白一定時間待其與腫瘤細胞結(jié)合后直接給予前藥進行治療，治療方案簡單；β-內(nèi)酰胺酶與底物親和力高，作用時不需要輔酶；作為一種可溶性蛋白，β-內(nèi)酰胺酶可以在大腸桿菌中量產(chǎn)，便于產(chǎn)業(yè)化；因此非常適合作為ADEPT系統(tǒng)中的酶。
　　 我們選擇RGD4C和β-內(nèi)酰胺酶(βL)重組構(gòu)建RGD4C-β-內(nèi)酰胺酶融合蛋白(RGD4CβL)作為ADEPT系統(tǒng)的單抗-酶偶聯(lián)物，并考察了該融合蛋白的活性，血漿穩(wěn)定性，免疫原性，靶向性；并合成了對應(yīng)的前

6、藥頭孢-美法侖，檢測了RGD4CβL對前藥的催化活性，考察了該系統(tǒng)對人乳腺癌細胞MCF-7的殺傷作用。
　　 本實驗采用頭孢硝噻吩作為底物，考察RGD4CβL的活性；并以人血漿孵育的方法考察了RGD4CβL的穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明RGD4CβL保留了β-內(nèi)酰胺酶的催化活性，其在人血漿中37℃孵育14天仍保留了較好的活性。
　　 本實驗采用人外周血單核細胞增殖試驗和小鼠脾細胞增殖試驗考察RGD4CβL的免疫原性，實驗結(jié)果表明

7、RGD4CβL對人外周血單核細胞和小鼠脾細胞的刺激作用均在可接受范圍，具有較小的免疫原性。
　　 本實驗采用流式細胞術(shù)考察了RGD4CβL對MCF-7細胞的結(jié)合能力；并用放射性125I標(biāo)記，利用小動物活體成像和組織分布實驗考察了RGD4CβL在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布特性。實驗結(jié)果表明RGD4CβL對MCF-7細胞有較好的結(jié)合能力，且該能力與RGD4C相當(dāng)；活體成像和組織分布實驗表明，RGD4CβL在腫瘤組織的分布高于正常組織，且主要

8、通過泌尿系統(tǒng)代謝。兩個實驗證明RGD4CβL具有一定的腫瘤靶向性。
　　 本實驗合成了RGD4CβL的對應(yīng)底物，頭孢-美法侖前藥；并用細胞增殖試驗考察了RGD4CβL-頭孢美法侖系統(tǒng)對MCF-7細胞的作用。實驗結(jié)果表明RGD4CβL和頭孢美法侖前藥對細胞無毒性；只有在兩者聯(lián)合應(yīng)用時才能釋放原藥美法侖產(chǎn)生細胞毒作用。
　　 通過以上實驗可以得知，RGD4CβL融合蛋白保留了RGD4C的靶向性和β-內(nèi)酰胺酶的催化活性，且具有