RGD-Melittin融合基因的表達(dá)純化及活性測(cè)定.pdf

1、免疫毒素是一類特異殺傷腫瘤細(xì)胞的藥物，能以抗體或細(xì)胞因子為導(dǎo)向載體(該抗體或細(xì)胞因子能與腫瘤細(xì)胞表面特異表達(dá)的抗原或受體結(jié)合)同毒素相連，對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行特異殺傷的嵌合蛋白。正電性抗菌肽由于其獨(dú)特的細(xì)胞毒機(jī)制日益引起人們的關(guān)注，而蜂毒溶血肽作為其中典型的一種，具有多種生理活性。本文以大腸桿菌為宿主重組表達(dá)Melittin；以Melittin為毒性部分，RGD(精-甘-天冬氨酸三肽)為靶向部分，構(gòu)建膜毒性免疫毒素RGD-Mel；并用pET-

2、30a為表達(dá)載體，對(duì)嵌合蛋白進(jìn)行了重組融合表達(dá)，初步檢測(cè)了該嵌合蛋自的體外活性。本研究得到的主要結(jié)果如下： 從處于活躍表達(dá)蜂毒溶血肽時(shí)期的中華蜜蜂工蜂毒腺中提取了總RNA，用TaqDNA聚合酶通過RT-PCR獲得了中蜂Melittin成熟區(qū)的cDNA。在實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，與在37-42℃用AMV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄相比，在較高溫度下用Taq DNA聚合酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄有利于獲得正確、完整的cDNA。 用pUC18載體構(gòu)建的p13CT克隆

3、載體克隆了中蜂Melittin成熟區(qū)的cDNA，測(cè)序結(jié)果顯示中蜂Melittin成熟區(qū)序列與意蜂的相比，中蜂在第33位發(fā)生了一個(gè)堿基的差異，但這一變異對(duì)氨基酸序列無(wú)影響，即中蜂與意蜂Melittin的氨基酸序列完全一致。 本文采用基因工程的方法，將RGD與中蜂Melittin連接，以大腸桿菌為重組表達(dá)宿主，pET30a為表達(dá)載體，對(duì)該嵌合蛋白進(jìn)行了高效表達(dá)，并分離純化了該融合蛋白。經(jīng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)初步證明該融合蛋白有明顯的腫瘤殺傷

4、作用：當(dāng)天然蜂毒素的濃度達(dá)到5.0μg/mL時(shí)，其腫瘤抑制率為39.6％，RGD-Mel在濃度為5.0 μg/mL時(shí)，其腫瘤抑制率已達(dá)到45.5％，且RGD-Mel濃度為3.0μg/mL時(shí)的腫瘤抑制率已相當(dāng)于天然蜂毒素在濃度為5.0μg/mL時(shí)的抑制率。 重組蛋白R(shí)GD-Mel是一種膜毒性抗腫瘤免疫毒素，在體外表現(xiàn)了明顯的腫瘤殺傷活性，但尚需進(jìn)行體內(nèi)試驗(yàn)以進(jìn)一步驗(yàn)證其抗腫瘤活性。本研究在腫瘤的導(dǎo)向治療和臨床方面將有很大的潛在應(yīng)用