成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(rhFGF19-rhFGF20)SUMO融合蛋白高效表達(dá)、純化及活性測(cè)定的研究.pdf

1、第一部分 SUMO-rhFGF19融合蛋白在Ni親和層析柱上的同步復(fù)性與純化，及其活性檢測(cè)
　　目的:重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子19(rhFGF19)能調(diào)控糖脂代謝和膽汁酸代謝，具有重要的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。然而，以大腸桿菌為載體實(shí)現(xiàn)高水平表達(dá)時(shí)，rhFGF19以無生物活性的包涵體形式存在，需要經(jīng)過繁瑣且耗時(shí)的液相透析復(fù)性才能得到活性蛋白。本研究擬表達(dá)SUMO-rhFGF19并利用融合蛋白中SUMO標(biāo)簽與Ni親和層析柱特異性親和的特性

2、，開展融合蛋白固相復(fù)性。復(fù)性成功后用SUMO蛋白酶特異性切除N端SUMO標(biāo)簽從而獲得具有生物活性的rhFGF19。本研究中的固相復(fù)性既為獲得高產(chǎn)量高純度的rhFGF19提供了新方法，也為其他非可溶性表達(dá)蛋白的復(fù)性提供了參考。
　　方法:選用BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)染SUMO-rhFGF19融合蛋白質(zhì)粒，培養(yǎng)菌體至OD600約為0.8～1.2，加入1 mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)。收集菌體，用裂解緩沖液(25mM Tris-H

3、Cl，pH8.0，10％(V/V)甘油，150 mM NaCl）重懸冰浴破碎，高速離心收集上清和沉淀部分（包涵體蛋白），將包涵體用變性緩沖液(25 mM Tris-HCl，pH8.0，6M脲，50 mMβ-巰基乙醇，150 mM NaCl)室溫溶解2小時(shí)，后在4℃，20000 rpm條件下離心30分鐘，除去不溶物。最后選用0.22μm濾膜過濾變性蛋白，稀釋至特定濃度后進(jìn)行柱上復(fù)性。
　　研究變性蛋白濃度對(duì)復(fù)性效率和生物學(xué)活性的影響

4、:將蛋白稀釋至1/2.5/7.5mg/mL，分別上樣至預(yù)先用10個(gè)柱體積(CVs)變性緩沖液A平衡過的Ni親和層析柱中，后用變性緩沖液A以2 mL/min繼續(xù)平衡柱子至5 CVs。接著按照0.1mL/min流速用復(fù)性緩沖液(25 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl，0.5M尿素，1 mM GSSG，5mMGSH)置換變性緩沖液(Buffer B:0～100％; Buffer A:100％～0)，柱上復(fù)性12h。復(fù)

5、性結(jié)束后以1.0 mL/min流速，用平衡緩沖液(25 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl)和洗脫緩沖液(25 mM Tris-HCl pH8.0，150 mM NaCl，1 M imidazole)梯度(Buffer D:0～100％; Buffer C:100％～0)洗脫約10 CVs。
　　研究復(fù)性時(shí)間對(duì)復(fù)性效率和生物學(xué)活性的影響:將蛋白稀釋至1 mg/mL，分別注射至預(yù)先用10個(gè)柱體積(CVs)變性

6、緩沖液A平衡過的Ni親和層析柱中，后用變性緩沖液A以2 mL/min，繼續(xù)平衡柱子5CVs。接著按照0.1 mL/min流速用復(fù)性緩沖液B置換變性緩沖液A(Buffer B:0～100％; Buffer A:100％～0)，分別柱上復(fù)性4/8/12 h，并按上述方法進(jìn)行洗脫。
　　1 mg/mL的復(fù)性蛋白與SUMO蛋白酶以1∶10比例混合孵育，4℃酶切16h。酶切蛋白混合液用Ni親和層析柱純化，SUMO，SUMO-rhFGF19以

7、及SUMO蛋白酶會(huì)與Ni親和層析柱結(jié)合，酶切獲得的rhFGF19則在柱子流穿液中。選用rhFGF19單克隆抗體檢驗(yàn)所獲目標(biāo)蛋白。
　　體外生物學(xué)活性檢測(cè)，選用HepG2細(xì)胞給藥rhFGF190/0.4/2/10μg/mL刺激30分鐘，Western blotting檢測(cè)p-ERK1/2變化情況。體內(nèi)生物學(xué)活性檢測(cè)，選用野生型C57BL/6小鼠尾靜脈注射0/10/100μg rhFGF19，給藥兩小時(shí)后取肝臟組織，用Trizol法提

8、取總RNA，后Sybrgreen熒光標(biāo)記的RT-PCR測(cè)定Cyp7α1表達(dá)量。
　　結(jié)果:SUMO-rhFGF19融合蛋白實(shí)現(xiàn)了高水平表達(dá)，但結(jié)果表明融合蛋白仍以包涵體形式存在。選用Ni親和層析柱成功復(fù)性并純化獲得SUMO-rhFGF19融合蛋白，進(jìn)一步利用SUMO蛋白酶特異性酶切獲得了rhFGF19。體外HepG2細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明，所獲得rhFGF19能有效激活細(xì)胞ERK1/2通路，增加p-ERK1/2水平。小鼠體內(nèi)給藥rhFGF1

9、9能有效抑制肝Cyp7α1 mRNA水平，并呈現(xiàn)劑量依賴性。體內(nèi)活性檢測(cè)結(jié)果證明本法所獲得的rhFGF19具有生物學(xué)活性。
　　結(jié)論:本研究提出了利用Ni親和層析柱進(jìn)行SUMO-rhFGF19融合蛋白復(fù)性和純化的新工藝。Westem blotting檢測(cè)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分析證實(shí)該方法成功一步實(shí)現(xiàn)了蛋白的復(fù)性與純化。研究也證實(shí)變性蛋白濃度對(duì)利用Ni親和層析柱進(jìn)行柱上復(fù)性影響極小，而脲濃度梯度改變較緩復(fù)性時(shí)間較長(zhǎng)則更能促進(jìn)蛋白復(fù)性。

10、　　第二部分 SUMO-rhFGF20融合蛋白的表達(dá)，純化及活性測(cè)定研究
　　目的:重組人成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子20(rhFGF20)可以抑制多巴胺能神經(jīng)元的凋亡，具有對(duì)帕金森病等神經(jīng)疾病潛在的治療價(jià)值。然而，與rhFGF19一樣，rhFGF20在大腸桿菌中以包涵體形式表達(dá)，需要步驟繁瑣且耗時(shí)長(zhǎng)久的透析復(fù)性才能得到很少的活性蛋白，這大大影響了對(duì)其研究的推進(jìn)。本研究擬通過構(gòu)建了SUMO-rhFGF20融合蛋白，來實(shí)現(xiàn)FGF20蛋白高效可

11、溶性表達(dá)，進(jìn)而大大簡(jiǎn)化rhFGF20的蛋白表達(dá)與純化步驟。
　　方法:選用BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)染SUMO-rhFGF20融合蛋白質(zhì)粒，20℃培養(yǎng)菌體至OD600約為0.8～1.2，加入1mM IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16小時(shí)。收集菌體，用裂解緩沖液(25 mM Tris-HCl，pH8.0，10％(V/V)甘油，150 mM NaCl）重懸冰浴破碎，高速離心收集上清和沉淀部分。用0.22μm濾膜過濾上清可溶性蛋白，用結(jié)合緩沖液A

12、(25 mMTris-HCl，pH8.0，150 mM NaCl，50 mM Imidazole)稀釋5倍過Ni親和層析柱。所得SUMO-rhFGF20蛋白與SUMO蛋白酶以1∶10比例混合孵育，4℃酶切16h。酶切蛋白混合液用Source-Q陰離子交換柱純化。選用rhFGF20單克隆抗體檢驗(yàn)所獲目標(biāo)蛋白。
　　體外生物學(xué)活性檢測(cè):選用NIH3T3細(xì)胞MTT活性實(shí)驗(yàn)，給藥0、25、50、100、200、400 ng/mL。同時(shí)NI

13、H3T3細(xì)胞給藥rhFGF200/0.1/0.5/2.5μg/mL刺激30分鐘，Western blotting檢測(cè)p-ERK1/2變化情況。
　　結(jié)果:SUMO-rhFGF20融合蛋白實(shí)現(xiàn)了高效可溶性表達(dá)。選用Ni親和層析柱成功純化獲得SUMO-rhFGF20融合蛋白，進(jìn)一步利用SUMO蛋白酶特異性酶切并純化獲得了rhFGF20。NIH3T3細(xì)胞MTT和Western blotting實(shí)驗(yàn)證明，所獲得rhFGF20能有效激活細(xì)胞