HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因原核表達(dá)、純化與復(fù)性的研究.pdf

1、棉鈴蟲核型多角體病毒是我國第一個商品病毒殺蟲劑，具有使用安全，害蟲不產(chǎn)生抗性等優(yōu)點(diǎn)，是一種很有發(fā)展?jié)摿Φ目商娲镛r(nóng)藥。目前中國棉鈴蟲單粒包埋型核型多角體病毒(HaSNPV)的基因組序列已經(jīng)測序完成，在HaSNPV基因組中發(fā)現(xiàn)了18家族幾丁質(zhì)酶的序列，該幾丁質(zhì)酶基因是一個晚期非必需基因。由于HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因與受染蟲體液化和病毒侵染機(jī)制密切相關(guān)，因而該基因的研究日益引起了人們的重視。 在本研究中我們將刪除了N端20個氨基

2、酸的信號肽和C端4個氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位序列的HaSNPV幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建到高效原核表達(dá)載體pET28a(+)中，經(jīng)測序檢驗后，轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌Rosetta(DE3)，以IPTG為誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)表達(dá)。最佳IPTG誘導(dǎo)濃度為0.5mM，最佳誘導(dǎo)時間為3h以上，(His)6-chiA蛋白可占總蛋白的22.6％，1mL液約含(His)6-chiA蛋白65μg，但是(His)6-chiA蛋白主要以包涵體的形式表達(dá)。為了得到可溶性蛋白，我們還將HaSN

3、PV的幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建到pMAL-c2X載體中，pMAL體特別有利于外源蛋白的正確折疊，從而形成可溶性的蛋白。MBP-chiA融合蛋白可占總蛋白的14.7％，1mL菌液約含MBP-chiA蛋白47μg，而可溶性的MBP-chiA蛋白占到總MBP-chiA蛋白的30％以上。雖然依舊沒有獲得有活性的蛋白，但為進(jìn)一步的研究奠定基礎(chǔ)。 在本研究中我們大量培養(yǎng)含有pET28a(+)-chiA質(zhì)粒的Rosetta(DE3)，誘導(dǎo)表達(dá)，收集

4、包涵體蛋白，對其進(jìn)行初步洗滌純化，然后用8M尿素溶解，在變性條件下(8M尿素)經(jīng)鎳-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱進(jìn)行親和層析純化，得到的電泳純的重組幾丁質(zhì)酶蛋白，純度可達(dá)95％以上。然后，我們采用了逐步透析的方法對電泳純的包涵體蛋白進(jìn)行復(fù)性，于4℃分別對100mL尿素濃度依次為6M-5M-4M-3M-2M-1M-0M的透析液進(jìn)行透析，每組透析液透析12h，復(fù)性效率為28％，1mg復(fù)性后蛋白的活性為0.3U。我們也采用了柱上復(fù)性的方法對