樺褐孔菌纖維素酶基因的原核表達(dá)與純化.pdf

1、樺褐孔菌Inonotus obliquus(Ach.exPers.) Pilát，是一種非常珍貴的藥用菌，菌核為主要藥用價(jià)值部位，其在抗腫瘤、抗高血壓、降血糖、提高免疫力等方面有顯著療效，一直深受人們的喜愛。然而樺褐孔菌野生資源十分稀少，且野生的樺褐孔菌在樺樹上要經(jīng)過10-15年才具有良好的藥用價(jià)值，因此樺褐孔菌人工栽培工作的探索迫在眉睫。目前樺褐孔菌菌核的栽培已取得成功，但產(chǎn)量較低，研究證明，胞外酶活性變化與菌核生長(zhǎng)關(guān)系密切，繼而本試

2、驗(yàn)以樺褐孔菌JL01為試材，繼續(xù)在與菌核發(fā)育有關(guān)的胞外酶——纖維素酶的分子水平上展開研究，為進(jìn)一步了解胞外酶的蛋白質(zhì)功能和分泌表達(dá)變化規(guī)律，以及建立高效的外源表達(dá)載體提供理論依據(jù)，具體實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.克隆并獲得了樺褐孔菌JL01菌株中內(nèi)切葡聚糖酶(endoglucanase，IO-EG)和β-葡萄糖苷酶(beta-glucosidase，IO-BGL)的ORF序列，β-葡萄糖苷酶的ORF序列與Gen bank中公布的ORF

3、序列完全吻合，而內(nèi)切葡聚糖酶的ORF序列與Gen bank中公布的ORF序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)1092個(gè)堿基T缺失，導(dǎo)致ORF序列改變，得到了新的內(nèi)切葡聚糖酶ORF序列，新基因命名為egⅠ，egⅠ的ORF序列全長(zhǎng)為1149 bp，編碼382個(gè)氨基酸，推測(cè)的蛋白分子量為40.1 kDa，理論等電點(diǎn)為4.78，序列比對(duì)和功能分析鑒定后，確定其為纖維素酶糖苷水解酶第5家族;
　　2.構(gòu)建了樺褐孔菌內(nèi)切葡聚糖酶基因(egⅠ)和β-葡萄糖苷酶基因（

4、bgl）原核表達(dá)載體，并命名為pET-30a-egⅠ和pET-30a-bgl;
　　3.IO-EG和IO-BGL原核表達(dá)載體pET-30a-egⅠ和pET-30a-bgl正確導(dǎo)入大腸桿菌BL21中，并獲得穩(wěn)定表達(dá)的蛋白，SDS結(jié)果顯示蛋白均以包涵體形式存在，IO-EG和IO-BGL重組蛋白分子質(zhì)量分別約為40 kDa和90 kDa;
　　4.采用Ni-IDA蛋白純化試劑盒在變性條件下對(duì)目的蛋白進(jìn)行純化，純化后的IO-EG蛋白