環(huán)二核苷酸合成酶基因丙酸誘導型表達載體的構(gòu)建及原核表達.pdf

1、環(huán)二核苷酸(Cyclic di-nucleotides)是目前發(fā)現(xiàn)的重要的第二信使分子。研究表明它們能傳遞多種細胞外的不同信息，調(diào)節(jié)大量不同的生理生化過程，如細菌的生物膜形成和宿主天然免疫應答，可用于免疫治療、免疫預防或疫苗佐劑用于人和動物的臨床研究。鑒于環(huán)二核苷酸的重要功能及其應用價值，本試驗對10種環(huán)二核苷酸合成酶基因進行原核表達載體構(gòu)建及體外誘導表達，以期為c-GAMP及c-di-GMP體外合成及疫苗佐劑研究奠定基礎。
　　

2、首先，本試驗通過對10個不同物種來源的環(huán)二核苷酸合成酶基因及丙酸誘導型載體的多克隆位點的核苷酸序列進行分析，設計BamHⅠ和XhoⅠ兩個限制性內(nèi)切酶位點用于10個不同物種環(huán)二核苷酸合成酶丙酸誘導型載體構(gòu)建;PCR擴增和酶切獲取10個不同物種環(huán)二核苷酸合成酶基因的線性片段后，用T4連接酶將10個基因與相同雙酶切處理的載體連接后轉(zhuǎn)化至E.coli BL21(DE3);利用雙酶切及測序的方法鑒定重組質(zhì)粒;構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒經(jīng)丙酸鈉誘導表達后，

3、SDS-PAGE電泳鑒定重組蛋白的表達;對有重組蛋白表達的菌體超聲破碎，取上清樣品進行Western blot分析鑒定重組蛋白是否為可溶性表達。試驗結(jié)果表明成功構(gòu)建了10個不同物種的環(huán)二核苷酸合成酶基因的丙酸誘導型原核表達重組質(zhì)粒，8個重組質(zhì)粒在BL21中有表達且為可溶性表達。
　　其次，利用Ni-NTA Agarose親和純化霍亂弧菌環(huán)二核苷酸合成酶VC0179重組蛋白并用TEV酶切獲取靶蛋白。體外酶促反應檢測VC0179重組蛋