法夫酵母蝦青素合成酶基因的原核表達(dá)研究及其表達(dá)差異分析.pdf

1、集萎夫?qū)W碩士學(xué)位論文法夫酵母蝦青素合成酶基因的原核表達(dá)研究及其表達(dá)差異分析ProkaryoticexpressionofBcaroteneconvertingenzyme(Asy)geneandanalysisofitsdifferentialexpressionin尸：haffiarhodoz)rensionartiarnoaozyma_I，舶學(xué)科門(mén)類(lèi)：堡堂論文答辯日期：2Q呈2生魚(yú)月蘭旦法夫酵母p胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶基因的原核表達(dá)研究及其

2、表達(dá)差異分析摘要蝦青素(astaxanthin)是一種抗氧化性能極強(qiáng)的天然類(lèi)胡蘿卜素，具有著色、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力等多種生物學(xué)功能，被廣泛的利用于水產(chǎn)養(yǎng)殖、醫(yī)藥、保健食品等行業(yè)中。法夫酵母是一種重要的天然蝦青素資源，其體內(nèi)的8一胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶(Asy)是目前發(fā)現(xiàn)唯一一個(gè)直接參與氧化B胡蘿卜素成為蝦青素的酶，但是關(guān)于該酶及編碼該酶的基因(asy)的研究相對(duì)較少。本文針對(duì)法夫酵母中的asy基因進(jìn)行了以下的研究：1、采用eDNA末端快速擴(kuò)增技

3、術(shù)，克隆得到法夫酵母(Phaffiarhodozyma)7812菌株的asy基因全長(zhǎng)eDNA序列(AccessionNOHM2047081)，該序列總長(zhǎng)1971bp，最大開(kāi)放閱讀框?yàn)?614bp，可編碼538個(gè)氨基酸，與GenBank能檢索到的的唯一一條asy基因mRNA序列(AccessionNODQ0020071)一致性達(dá)到97％。2、將asy基因的eDNA克隆到pET32a載體后，轉(zhuǎn)化EcoliBL21(DE3)菌株進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)

4、的Asy融合蛋白分子量約為70kDa；優(yōu)化后，在26℃，05mmol／LIPTG的條件下誘導(dǎo)時(shí)，可溶性融合蛋白比例可提高至85％；進(jìn)一步在EcoliBL21(DE3)中共表達(dá)攜帶asy基因的質(zhì)粒和pACCARl6Acrtx質(zhì)粒(攜帶由乙酰輔酶A合成B胡蘿卜素的基因鏈)，采用液相色譜分析共轉(zhuǎn)化菌株的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)物時(shí)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，共轉(zhuǎn)化菌株的類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)物的成分發(fā)生了明顯變化，其中0【胡蘿卜素的含量明顯減少，伴隨出現(xiàn)了三種新的色素，根據(jù)

5、出峰時(shí)間判斷其中一種為p胡蘿卜素和蝦青素的中間產(chǎn)物6隱黃質(zhì)。3、初步分析四個(gè)具有不同發(fā)酵特征和產(chǎn)類(lèi)胡蘿卜素特性的菌株中類(lèi)胡蘿卜素、口一胡蘿卜素和蝦青素的合成量與asy基因表達(dá)量的關(guān)系發(fā)現(xiàn)：JMULY322和JMU15spw的產(chǎn)物中檢測(cè)不到蝦青素，但是這兩個(gè)菌株的asy基因均有表達(dá)；JMUMVPl4和JMUVDL668能合成蝦青素，48h時(shí)，前者的asy基因表達(dá)量高于后者，培養(yǎng)48h和120h時(shí)，JMU—MVPl4的總類(lèi)胡蘿卜素、B胡蘿卜

6、素和蝦青索的產(chǎn)率都比JMU—VDL668高，由此可以看出，相對(duì)于JMUVDL668，JMUMVPl4的asy基因的高效表達(dá)可能是該菌高產(chǎn)蝦青素的原因之一。4、在搖瓶培養(yǎng)的不同時(shí)間添加B胡蘿卜素，JMUVDL668的總類(lèi)胡蘿卜素產(chǎn)量總是維持在300—400gg／g的水平。當(dāng)JMU—VDL668自身合成的總類(lèi)胡蘿卜素含量接近或低于300gg／g時(shí)，可以吸收環(huán)境中的B一胡蘿卜素，這說(shuō)明JMU—VDL668細(xì)胞內(nèi)的總類(lèi)胡蘿卜素含量可能存在一個(gè)閾