PTEN和GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽在游離脂肪酸誘導(dǎo)β細(xì)胞損傷中作用的研究.pdf

1、肥胖是2型糖尿病(T2DM)發(fā)生和發(fā)展最主要的危險(xiǎn)因素，其顯著特征是患者體內(nèi)游離脂肪酸（Freefattyacid，F(xiàn)FA）持續(xù)升高。越來(lái)越多的證據(jù)表明，血漿FFA濃度的升高不僅可以增加周?chē)M織的胰島素抵抗，還可以損害β細(xì)胞功能，抑制葡萄糖刺激的胰島素分泌和β細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡，降低β細(xì)胞數(shù)量，最終導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生與發(fā)展。因此，減少FFA對(duì)β細(xì)胞損傷可能是一種新的2型糖尿病治療策略。
　　PTEN是一個(gè)具有磷酸酶活性的抑癌基

2、因，其突變?nèi)笔Э蓪?dǎo)致很多腫瘤的發(fā)生。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，PTEN除在腫瘤的發(fā)生中發(fā)揮重要作用外，在糖尿病的發(fā)生與發(fā)展中也起到一定的作用。Akt是PTEN主要的下游基因，還受到PI3K的調(diào)節(jié)，而胰島素受體底物（IR2/PI3K）通路在β細(xì)胞功能和數(shù)量的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要的作用。因此，PTEN可以通過(guò)拮抗PI3K通路影響β細(xì)胞功能。另外，PTEN的磷酸酶活性可以將PIP3去磷酸化為PIP2。PIP2是一個(gè)重要的內(nèi)源性的ATP敏感性鉀離子通道調(diào)節(jié)因子。

3、因此PTEN可能通過(guò)PIP2間接調(diào)節(jié)KATP通道，影響胰島素分泌。
　　利拉魯肽是一種經(jīng)過(guò)修飾的GLP-1類(lèi)似物。GLP-1對(duì)β細(xì)胞有一定的保護(hù)作用，它不僅可以提高葡萄糖刺激的胰島素分泌，改善β細(xì)胞功能，而且還可以促進(jìn)β細(xì)胞增殖，抑制β細(xì)胞凋亡。研究表明，GLP-1的這些功能是可以通過(guò)對(duì)KATP通道和Akt通路的調(diào)節(jié)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。因此利拉魯肽有可能通過(guò)對(duì)KATP通道和Akt通路的調(diào)節(jié)來(lái)改善PTEN介導(dǎo)的游離脂肪酸對(duì)β細(xì)胞的損傷。

4、>　　為了探討PTEN和利拉魯肽在游離脂肪酸誘導(dǎo)β細(xì)胞損傷中的作用，本研究進(jìn)行了如下實(shí)驗(yàn)：
　　實(shí)驗(yàn)一、PTEN在游離脂肪酸誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡中的作用
　　目的：探討PTEN在游離脂肪酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡中是否發(fā)揮作用。方法：應(yīng)用棕櫚酸處理βTC-3細(xì)胞，構(gòu)建FFA誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡模型，應(yīng)用siRNA敲除PTEN。分別應(yīng)用MTT比色實(shí)驗(yàn)，流式法檢測(cè)細(xì)胞活力和細(xì)胞凋亡情況。采用RealtimePCR和Westernblot法檢測(cè)PTE

5、NmRNA和蛋白水平的變化。應(yīng)用Westernblot法檢測(cè)p-Akt，Akt和Active-Caspase3的改變。結(jié)果：MTT和流式結(jié)果顯示棕櫚酸可以降低β細(xì)胞活力，誘導(dǎo)β細(xì)胞凋亡。Westernblot結(jié)果顯示經(jīng)棕櫚酸處理24h后β細(xì)胞p-PTEN和p-Akt蛋白表達(dá)下降，Active-Caspase3蛋白表達(dá)增加。RealtimePCR檢測(cè)結(jié)果顯示棕櫚酸處理后β細(xì)胞PTENmRNA增加。β細(xì)胞經(jīng)PTENsiRNA轉(zhuǎn)染后，棕櫚酸誘

6、導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡減少，p-Akt蛋白表達(dá)增加，Active-Caspase3蛋白表達(dá)減少。結(jié)論：棕櫚酸可以促進(jìn)PTEN轉(zhuǎn)錄，增加PTEN活性，從而抑制Akt激活促進(jìn)β細(xì)胞凋亡。PTEN參與了棕櫚酸誘導(dǎo)的β細(xì)胞凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)二、PTEN對(duì)β細(xì)胞ATP敏感性鉀離子通道的影響
　　目的：探討游離脂肪酸對(duì)β細(xì)胞ATP敏感性鉀離子通道影響及PTEN在此過(guò)程中的作用。方法：βTC-3細(xì)胞經(jīng)棕櫚酸處理24h后應(yīng)用放免法檢測(cè)2.8mM和22

7、.4mM葡萄糖刺激的胰島素分泌。再分別應(yīng)用Dotblot和RealtimePCR檢測(cè)KATP通道活性相關(guān)基因PIP2和KATP通道亞基Kir6.2和SUR1mRNA的表達(dá)。βTC-3細(xì)胞分別經(jīng)ControlsiRNA和PTENsiRNA轉(zhuǎn)染后，再用1mM棕櫚酸處理24h，應(yīng)用RealtimePCR檢測(cè)Kir6.2和SUR1mRNA的表達(dá)。結(jié)果：細(xì)胞經(jīng)棕櫚酸處理后葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）,Kir6.2和SUR1的mRNA下降，P

8、IP2增加。經(jīng)PTENsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的Kir6.2和SUR1mRNA表達(dá)高于經(jīng)ControlsiRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞。結(jié)論：PTEN通過(guò)調(diào)節(jié)PIP2和KATP通道亞基Kir6.2和SUR1參與FFA對(duì)β細(xì)胞ATP敏感性鉀離子通道影響。
　　實(shí)驗(yàn)三、利拉魯肽對(duì)游離脂肪酸介導(dǎo)的β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用
　　目的：探討GLP-1類(lèi)似物利拉魯肽對(duì)游離脂肪酸介導(dǎo)β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法：βTC-3細(xì)胞經(jīng)利拉魯肽處理24h后，應(yīng)用Realt

9、imePCR檢測(cè)Kir6.2mRNA。細(xì)胞單獨(dú)經(jīng)利拉魯肽處理24h，或經(jīng)利拉魯肽預(yù)處理1h之后加入棕櫚酸共孵育24h，用RealtimePCR檢測(cè)Kir6.2mRNA，應(yīng)用Westernblot檢測(cè)p-Akt、Akt、Active-Caspase3的表達(dá)。結(jié)果：經(jīng)利拉魯肽處理后Kir6.2mRNA和p-Akt表達(dá)增加，Active-Caspase3表達(dá)下降。利拉魯肽與棕櫚酸共孵育細(xì)胞組Kir6.2mRNA和p-Akt高于單獨(dú)棕櫚酸處理的