玻連蛋白與放射性肺纖維化相關(guān)性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、放射治療是胸部腫瘤的主要治療手段之一。雖然放療劑量的增高有助于腫瘤的局部控制與提高患者生存率，然而，由于在放療過程中正常肺組織不可避免的受到照射，隨放療劑量的升高，放射性肺損傷的發(fā)生率與程度也將增加。急性期放射性肺損傷是在放療后3個(gè)月內(nèi)可能出現(xiàn)的急性并發(fā)癥;3個(gè)月后，胸部放療患者又面臨著發(fā)生晚期并發(fā)癥放射性肺纖維化的可能。放射性肺纖維化主要由損傷后持續(xù)炎癥所致的過度修復(fù)產(chǎn)生，其特征是大量炎性因子、細(xì)胞因子和趨化因子的持續(xù)分泌所致的細(xì)胞外

2、基質(zhì)，包括透明質(zhì)酸、纖連蛋白、蛋白聚糖、以及膠原蛋白等的積聚。
　　本課題組前期為了篩選出預(yù)測(cè)放射性肺損傷的蛋白，對(duì)放療前患者的外周血進(jìn)行了蛋白組學(xué)分析，對(duì)比放射性肺毒性(radiation-induced lung toxicity) RILT≥2級(jí)與RILT＜2級(jí)患者的血清蛋白分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，玻連蛋白在RILT≥2級(jí)患者血清中基礎(chǔ)表達(dá)水平顯著高于RILT＜2級(jí)患者的表達(dá)水平(P=0.02)，提示玻連蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)量升高與放射后的

3、肺損傷相關(guān)，玻連蛋白可能扮演促進(jìn)放射性肺損傷發(fā)生發(fā)展的角色。此外，許多學(xué)者也發(fā)現(xiàn)玻連蛋白在其他病因所致肺間質(zhì)纖維化病人的外周血或肺內(nèi)含量增加，提示玻連蛋白作為肺纖維化產(chǎn)生調(diào)節(jié)因子的可能。
　　本實(shí)驗(yàn)先對(duì)體外培養(yǎng)肺成纖維細(xì)胞采用不同劑量137Cs照射后，觀察照射后不同時(shí)間點(diǎn)不同細(xì)胞株中玻連蛋白及膠原蛋白的表達(dá)變化，選擇出可致成纖維細(xì)胞輻照損傷的最佳實(shí)驗(yàn)條件。隨后，我們進(jìn)一步構(gòu)建了玻連蛋白過表達(dá)及干擾的慢病毒載體，以對(duì)成纖維細(xì)胞進(jìn)行玻

4、連蛋白表達(dá)調(diào)控，從而觀察在不同玻連蛋白表達(dá)水平中成纖維細(xì)胞輻照損傷程度的改變;最后，在C57BL小鼠體內(nèi)通過玻連蛋白調(diào)控慢病毒構(gòu)建不同玻連蛋白基礎(chǔ)表達(dá)水平的小鼠，從而觀察小鼠胸部輻照照射后放射性肺纖維化程度改變與玻連蛋白表達(dá)水平間的關(guān)系。
　　目的:
　　分析不同劑量照射后成纖維細(xì)胞中玻連蛋白及膠原蛋白表達(dá)改變及其時(shí)間變化規(guī)律，初步探討玻連蛋白作為輻射損傷指標(biāo)的意義;構(gòu)建玻連蛋白基因過表達(dá)及干擾的慢病毒載體，并轉(zhuǎn)染肺成纖維細(xì)

5、胞，檢測(cè)玻連蛋白在其中的表達(dá)水平，為進(jìn)一步探討該基因的功能提供研究工具和試驗(yàn)基礎(chǔ);研究不同基礎(chǔ)玻連蛋白表達(dá)量的肺成纖維細(xì)胞在輻照照射后發(fā)生纖維化的程度，探索玻連蛋白對(duì)纖維化過程調(diào)控通路的影響;通過慢病毒載體調(diào)控C57BL小鼠玻連蛋白基礎(chǔ)表達(dá)量，并研究不同玻連蛋白基礎(chǔ)表達(dá)量小鼠間放射性肺纖維化的程度改變。
　　材料與方法:
　　采用137Cs輻射源，對(duì)人胚肺成纖維細(xì)胞WI-38和IMR-90各照射0、4、6、8、10和12 G

6、y，并于照后6、12、24、36、48和60 h收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，采用Western Blot法檢測(cè)玻連蛋白和膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量，并采用Real-time PCR法及ELISA法分別檢測(cè)玻連蛋白在轉(zhuǎn)錄水平及細(xì)胞培養(yǎng)上清中的表達(dá)量。玻連蛋白過表達(dá)慢病毒的構(gòu)建，通過PCR擴(kuò)增玻連蛋白基因后插入到pCDH載體，通過菌落PCR初步篩選、雙酶切和測(cè)序鑒定構(gòu)建的pCDH-VTN重組載體和包裝質(zhì)粒采用脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞包裝慢病毒液制備

7、;玻連蛋白干擾慢病毒的構(gòu)建，先設(shè)計(jì)合成3個(gè)針對(duì)玻連蛋白基因干擾位點(diǎn)的shRNA序列，插入pLVX載體，構(gòu)建玻連蛋白干擾慢病毒。所構(gòu)建的過表達(dá)及干擾慢病毒分別轉(zhuǎn)染至WI-38細(xì)胞中，采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測(cè)玻連蛋白的相對(duì)表達(dá)，并篩選出干擾效率最強(qiáng)的干擾慢病毒。分別使用玻連蛋白過表達(dá)病毒、玻連蛋白干擾慢病毒及GFP病毒載體轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后予8 Gy137Cs單次輻照，照射后48 h測(cè)定各組細(xì)胞中玻連蛋白

8、、膠原蛋白及纖維化過程相關(guān)調(diào)節(jié)通路蛋白，探索玻連蛋白基礎(chǔ)表達(dá)量對(duì)于輻照損傷程度的影響。將玻連蛋白過表達(dá)慢病毒、玻連蛋白干擾慢病毒、空載慢病毒（陰性對(duì)照）或生理鹽水通過尾靜脈注射入C57BL小鼠，構(gòu)建不同玻連蛋白基礎(chǔ)表達(dá)水平的小鼠模型。給藥48 h后使用6 MV直線加速器對(duì)小鼠胸部予以12 Gy單次照射，構(gòu)建放射性肺纖維化的動(dòng)物模型，分別在照射后8周與12周處死小鼠，取小鼠肺組織，通過H.E.染色鏡下觀察、實(shí)時(shí)定量PCR、ELISA和We

9、stern Blot方法定性及定量地評(píng)估不同玻連蛋白表達(dá)組小鼠放射性肺纖維化發(fā)生的程度。
　　結(jié)果:
　　1.Western Blot結(jié)果顯示，受照射后兩種成纖維細(xì)胞照射后玻連蛋白及膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ表達(dá)呈正相關(guān)性(r=0.40～0.79，P＜0.05)，都顯著高于未經(jīng)照射的對(duì)照組(t＞3.04，P＜0.05)，且照射劑量與時(shí)間對(duì)蛋白的影響均呈現(xiàn)先增高后降低的變化趨勢(shì)。玻連蛋白與膠原蛋白在8～10Gy照后48 h，表達(dá)量最高(t

10、＞2.92，P＜0.05)。Real-time PCR結(jié)果與ELISA結(jié)果顯示，玻連蛋白mRNA表達(dá)及上清中含量受照射劑量影響較顯著(F=27.09～42.62，P＜0.05)，而受時(shí)間影響較小。2.玻連蛋白過表達(dá)慢病毒pCDH-VTN轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞后玻連蛋白mRNA及細(xì)胞內(nèi)蛋白表達(dá)水平均明顯增高(t=13.49，P＜0.05)。在所設(shè)計(jì)的3個(gè)針對(duì)玻連蛋白基因干擾位點(diǎn)的慢病毒中，對(duì)玻連蛋白表達(dá)的抑制效果最強(qiáng)的干擾慢病毒對(duì)玻連蛋白mR

11、NA表達(dá)的抑制與陰性對(duì)照組相比可達(dá)75％(t=50.1，P＜0.05)。所包裝過表達(dá)及干擾慢病毒經(jīng)濃縮后滴度測(cè)定均為1×107 TU/ml以上。3.在照射后，玻連蛋白過表達(dá)組成纖維細(xì)胞中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ細(xì)胞內(nèi)及上清中含量較對(duì)照（空病毒）組明顯升高（P＜0.05）;同時(shí)，所檢測(cè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)蛋白mRNA表達(dá)量及蛋白磷酸化水平亦有明顯增高;相反，在玻連蛋白干擾組成纖維細(xì)胞中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ較對(duì)照組明顯降低(P＜0.05)，而所檢測(cè)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)蛋白mRNA

12、表達(dá)量及蛋白磷酸化水平明顯降低。4.對(duì)小鼠全胸進(jìn)行單次12 Gy照射后8-12周，玻連蛋白過表達(dá)組小鼠肺組織中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、羥脯氨酸、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)含量均較對(duì)照組(GFP)顯著增高(P＜0.05)，鏡下觀察肺組織纖維化程度增加;玻連蛋白表達(dá)抑制組小鼠肺組織中膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ、羥脯氨酸、α-SMA及TGF-β1含量較對(duì)照組顯著降低（P＜0.05），鏡下觀察肺組織纖維化程度降低。
　　

13、結(jié)論:
　　1.137Cs照射后成纖維細(xì)胞中玻連蛋白在細(xì)胞內(nèi)、上清中及mRNA表達(dá)水平與膠原蛋白Ⅰ、Ⅲ含量呈正相關(guān)。而8 Gy137Cs照射及照射后48 h是探討照射后成纖維細(xì)胞放射性損傷的較優(yōu)體外實(shí)驗(yàn)條件。WI-38更適合于做輻射損傷體外實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞。2.玻連蛋白過表達(dá)及干擾慢病毒表達(dá)載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染W(wǎng)I-38細(xì)胞后分別可有效地升高和抑制的玻連蛋白表達(dá)水平。3.通過調(diào)節(jié)玻連蛋白的表達(dá)可影響體外培養(yǎng)成纖維細(xì)胞輻射損傷的改變，提示該