大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備及其向感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)研究.pdf

1、目的:
　　對(duì)大鼠BMSCs的體外分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增、鑒定及其向感覺(jué)神經(jīng)元誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立本實(shí)驗(yàn)室快速穩(wěn)定獲取大鼠BMSCs及其轉(zhuǎn)化為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞技術(shù)流程，為BMSCs內(nèi)耳移植治療感音神經(jīng)性耳聾提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)規(guī)范。
　　方法:
　　1、體外利用密度梯度離心法采集分離培養(yǎng)純化大鼠BMSCs，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD44、CD90、CD106、CD34、CD45表達(dá)情況，成骨及成脂誘導(dǎo)液誘導(dǎo)所獲得細(xì)胞

2、向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞分化，以茜素紅及油紅O染色法鑒定成骨分化中鈣結(jié)節(jié)及脂肪分化中脂滴的形成。
　　2、用兩步法誘導(dǎo)大鼠BMSCs為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞:第一步用添加EGF和IGF-1誘導(dǎo)液誘導(dǎo)BMSCs為內(nèi)耳神經(jīng)前體細(xì)胞，細(xì)胞免疫熒光驗(yàn)證其表面蛋白SOX2和PAX8表達(dá)情況，第二步分別用BMP4誘導(dǎo)組和無(wú)BMP4誘導(dǎo)組繼續(xù)向感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)，通過(guò)realtime-PCR比較各組間細(xì)胞內(nèi)NeuroD、Neurog1、GluR4、NF

3、-M基因mRNA水平，選取最優(yōu)誘導(dǎo)方案。最后通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞表面蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin、β-Ⅲ tubulin、Tau表達(dá)情況，對(duì)最優(yōu)方案誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。
　　結(jié)果:
　　1、通過(guò)規(guī)范化細(xì)胞制備技術(shù)獲取大量形態(tài)均一貼壁生長(zhǎng)細(xì)胞。流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示:細(xì)胞表面抗原CD44、CD90、CD106分別表達(dá)為99.9％、77.3％、99.5％;造血細(xì)胞來(lái)源的表面抗原C

4、D34和CD45分別表達(dá)為3.22％和4％。成脂誘導(dǎo)后油紅O染色可見(jiàn)脂滴，成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色可見(jiàn)橙紅鈣結(jié)節(jié)，證實(shí)我們獲取大量高純度的BMSCs。
　　2、Realtime-PCR結(jié)果顯示BMP4、SHH-和RA聯(lián)合誘導(dǎo)能顯著提升大鼠BMSCs內(nèi)NeuroD、Neurog1、GluR4、NF-M基因mRNA水平。誘導(dǎo)后細(xì)胞具有神經(jīng)元特殊形態(tài)，處于生長(zhǎng)平臺(tái)期，感覺(jué)神經(jīng)元相關(guān)蛋白Nestin、NeuN、GATA3、Calretinin

5、、β-Ⅲ tubulin、Tau陽(yáng)性，證實(shí)我們成功的將BMSCs誘導(dǎo)為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞。
　　結(jié)論:
　　1、本實(shí)驗(yàn)成功建立和優(yōu)化了BMSCs制備技術(shù)，規(guī)范了細(xì)胞采集、分離、培養(yǎng)及鑒定的流程，為獲取高質(zhì)量BMSCs提供了理論和實(shí)踐參考。
　　2、本實(shí)驗(yàn)成功建立了BMSCs誘導(dǎo)為感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù);通過(guò)realtime-PCR技術(shù)、細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞免疫熒光技術(shù)證明BMP4、SHH和RA聯(lián)合誘導(dǎo)可獲得高質(zhì)量感覺(jué)神