吸煙對巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運影響的在體和離體研究.pdf

1、吸煙是動脈粥樣硬化和冠心病發(fā)病的獨立危險因素。吸煙影響動脈粥樣硬化發(fā)生、發(fā)展的多個環(huán)節(jié)，可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂，促進(jìn)炎癥和氧化應(yīng)激的產(chǎn)生，引起血脂代謝異常以及促進(jìn)血栓形成。但是，吸煙促進(jìn)動脈粥樣硬化發(fā)生的確切機制目前仍不清楚。動脈粥樣硬化的形成是一個復(fù)雜的病理生理過程。膽固醇在巨噬細(xì)胞中過量聚集形成泡沫細(xì)胞，這是動脈粥樣硬化斑塊的主要細(xì)胞成分及特征性的病理改變。膽固醇逆轉(zhuǎn)運是將外周組織（包括動脈粥樣硬化斑塊）中過多的膽固醇轉(zhuǎn)運至肝臟，

2、進(jìn)而以糞便的形式被排出體外的過程。因此，膽固醇逆轉(zhuǎn)運可以減少膽固醇在血管壁沉積和抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成。膽固醇逆轉(zhuǎn)運是一個復(fù)雜的動態(tài)平衡過程。膽固醇流出是巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運的第一步，也是其限速步驟。膽固醇流出依賴于膽固醇轉(zhuǎn)運體腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ABCA1)、腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G1(ABCG1)、清道夫受體B1(SR-B1)的表達(dá)水平以及細(xì)胞外接受體高密度脂蛋白(HDL)的濃度和組成。膽固醇在肝臟中轉(zhuǎn)化為膽汁酸鹽，最后

3、經(jīng)腸腔排出體外，這是膽固醇逆轉(zhuǎn)運的最后步驟。腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G5(ABCG5)和腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體G8(ABCG8)參與膽固醇的肝腸排泄，在巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運中也起著重要作用。大量的研究表明，吸煙不僅可以降低HDL-C的血漿濃度，而且可以氧化修飾HDL，使HDL的抗動脈粥樣硬化作用降低。此外，吸煙可以對ABCG5和ABCG8產(chǎn)生影響。但是，目前尚不清楚吸煙是否影響小鼠在體巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運效率。
　　 目的：

4、>　　 本實驗將小鼠被動吸煙8周，采用一種替代方法研究吸煙對小鼠在體巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運的影響及其機制。并進(jìn)一步研究吸煙組小鼠血清以及香煙煙霧提取物(CSE)對巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響及機制。
　　 方法：
　　 14只雄性C57BL/6小鼠隨機分為對照組和吸煙組。吸煙組小鼠被動吸煙8周后腹腔注射經(jīng)乙?；兔芏戎鞍?Ac-LDL)及3H膽固醇處理過的小鼠巨噬細(xì)胞懸液，單獨籠養(yǎng)48小時后收集小鼠血清、肝臟、膽汁和糞便。

5、γ射線計數(shù)儀檢測血清、肝臟、膽汁和糞便中3H-膽固醇的放射活性并計算其占腹腔注射總量的百分比。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Westernblot法分別檢測分別肝臟和小腸中ABCG5/ABCG8的mRNA和蛋白表達(dá)。小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7與終濃度為50μg/ml的Ac-LDL以及1μCi/ml的3H-膽固醇共同孵育24小時使巨噬細(xì)胞荷脂和標(biāo)記，小鼠血清或香煙煙霧提取物作用于小鼠巨噬細(xì)胞，γ射線計數(shù)儀檢測巨噬細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞上

6、清液中3H-膽固醇含量并計算膽固醇流出的效率。采用Westernblot法檢測巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1、SR-B1、肝X受體α(LXRα)和過氧化酶體增殖物活化受體γ(PPARγ)的蛋白表達(dá)水平。并探討抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(NAC)或PPARγ的激動劑15-脫氧前列腺素J2(15d-PGJ2)對巨噬細(xì)胞膽固醇流出的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.吸煙組小鼠血清、肝臟、膽汁和糞便中3H-膽固醇的放射活性均顯著降

7、低。
　　 2.吸煙組小鼠血清介導(dǎo)巨噬細(xì)胞膽固醇流出的效率顯著降低。
　　 3.吸煙組小鼠肝臟和小腸組織中ABCG5/ABCG8的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著下降。
　　 4.吸煙組小鼠血清中HDL-C顯著下降，甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)均顯著升高。
　　 5.用抗氧化劑NAC預(yù)先作用于吸煙組小鼠血清1小時，可以顯著增加吸煙組小鼠血清介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇流出的效率。
　　 6.不同濃度的C

8、SE作用于巨噬細(xì)胞24小時，巨噬細(xì)胞膽固醇流出的效率顯著降低，且呈劑量依賴性。
　　 7.不同濃度的CSE作用于巨噬細(xì)胞24小時，巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1、PPARγ和LXRα的蛋白表達(dá)水平顯著降低，且呈劑量依賴性，而巨噬細(xì)胞中SR-B1的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差別。
　　 8.預(yù)先將PPARγ激動劑15d-PGJ2作用于巨噬細(xì)胞1小時，可以顯著性增加巨噬細(xì)胞膽固醇流出以及巨噬細(xì)胞中ABCA1、ABCG1和LXR

9、α蛋白表達(dá)，而巨噬細(xì)胞中SR-B1的蛋白表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差別。
　　 結(jié)論：
　　 1.吸煙顯著降低小鼠體內(nèi)巨噬細(xì)胞膽固醇逆轉(zhuǎn)運。
　　 2.吸煙顯著降低小鼠肝臟和小腸組織中ABCG5/ABCG8mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　 3.吸煙降低小鼠血清介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞膽固醇流出效率可能與其降低HDL膽固醇的水平以及促進(jìn)HDL脂質(zhì)過氧化有關(guān)。
　　 4.CSE通過抑制PPAR-γ-LXRα通路，使膽固