微泡介導(dǎo)超聲空化對(duì)前列腺通透性影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　前列腺常見疾病,包括前列腺炎、前列腺增生、前列腺癌在內(nèi),嚴(yán)重影響成年男性生存質(zhì)量,其發(fā)病機(jī)制、病理生理學(xué)改變尚不十分清楚,治療效果不理想,但不同的前列腺疾病之間存在著某些發(fā)病機(jī)制的聯(lián)系。目前,研究顯示前列腺炎癥在前列腺增生的病理生理變化和前列腺癌進(jìn)展中扮演關(guān)鍵性角色?；谇傲邢傺装Y可能為前列腺增生、前列腺癌等其他前列腺疾病的風(fēng)險(xiǎn)因素或病理生理變化的始動(dòng)機(jī)制,其治愈和預(yù)防處于最基本和最重要的地位。但是,前列腺炎患病率較高

2、,復(fù)發(fā)率也較高,包括抗感染在內(nèi)的藥物治療作為常見的基本治療措施之一,療效欠佳。一般認(rèn)為,前列腺炎對(duì)抗生素等藥物治療具有相對(duì)耐受性。大部分的藥物不能通過前列腺腺上皮從而在前列腺實(shí)質(zhì)內(nèi)達(dá)到有效治療濃度。這可能與前列腺組織內(nèi)具有某些特殊結(jié)構(gòu)有關(guān),可能存在實(shí)質(zhì)性的解剖學(xué)屏障阻礙了抗生素從血液循環(huán)進(jìn)入前列腺實(shí)質(zhì)和前列腺液中。因此,我們認(rèn)為血-前列腺屏障可能是由微血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜、肌纖維間質(zhì)層、腺上皮細(xì)胞等構(gòu)成,其組織結(jié)構(gòu)和功能有待深入研究。正

3、因其屏障功能,阻擋了某些藥物進(jìn)入前列腺腺體內(nèi)部形成有效濃度來發(fā)揮治療作用。同時(shí)組織炎癥可能改變前列腺局部微環(huán)境。發(fā)生炎癥時(shí),前列腺腺體周圍組織纖維增生,肌纖維間質(zhì)層明顯增厚,甚至出現(xiàn)膿腔周圍組織纖維化,均對(duì)藥物的屏障作用更為顯著。因此,要攻克前列腺外途徑給藥療效欠理想的難題,探尋新的治療方法,如何增強(qiáng)前列腺組織通透性,如何有效開放血-前列腺屏障,將是解決前列腺疾病治療的主要問題之一。
　　超聲作為一種無創(chuàng)性的診斷手段雖被廣泛地用于

4、臨床,但其空化效應(yīng)在治療領(lǐng)域的應(yīng)用研究逐漸增多。近年來,微泡作為造影劑應(yīng)用于超聲造影檢查中可以顯著提高診斷的準(zhǔn)確性,隨著對(duì)微泡在超聲場(chǎng)中產(chǎn)生振蕩的特性的深入研究,伴隨產(chǎn)生的生物學(xué)效應(yīng)也越來越受到人們的關(guān)注。較多的關(guān)于超聲造影劑的應(yīng)用基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn),當(dāng)引入微泡后可以明顯增強(qiáng)超聲能量的吸收,顯著降低超聲空化閾值,增強(qiáng)其生物學(xué)效應(yīng),也正因此超聲造影劑微泡由診斷轉(zhuǎn)入治療領(lǐng)域。在較低聲壓水平激發(fā)穩(wěn)態(tài)空化,微泡通過線性和(或)非線性振蕩產(chǎn)生的沖擊波、

5、微射流繼而引發(fā)的剪切力導(dǎo)致聲孔效應(yīng)發(fā)生,組織細(xì)胞表面出現(xiàn)“可恢復(fù)性”小孔,細(xì)胞之間緊密連接短暫性開放,可引起組織通透性的增加并隨即恢復(fù),這也就為增加局部組織藥物濃度和基因或藥物靶向傳輸治療某些疾病帶來了新的希望,本課題也正是基于此展開的。
　　微泡作為一種高效的外源性空化核,經(jīng)靜脈注入血液循環(huán)后,可以顯著提高體內(nèi)空化核的數(shù)量和濃度,明顯降低空化閾值,增強(qiáng)超聲空化效應(yīng)。而超聲空化產(chǎn)生的顯著的生物學(xué)效應(yīng),即聲孔效應(yīng),導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增

6、高,血管內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接開放已在較多的實(shí)驗(yàn)研究中被證實(shí),但國(guó)內(nèi)、外關(guān)于微泡介導(dǎo)超聲空化能否增強(qiáng)前列腺通透性,能否有效開放血-前列腺屏障以及主要機(jī)制如何,相關(guān)報(bào)道很少,值得進(jìn)一步研究。
　　目的：
　　探討微泡介導(dǎo)超聲空化增強(qiáng)前列腺通透性的可行性、有效性、安全性及可恢復(fù)性。擬在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水平,經(jīng)靜脈途徑將超聲造影劑微泡注入動(dòng)物血液循環(huán),設(shè)定能量參數(shù)的治療超聲靶向輻照前列腺,激勵(lì)前列腺局部微循環(huán)內(nèi)的微泡空化,利用超聲空化所致的

7、聲孔效應(yīng)開放血管內(nèi)皮細(xì)胞之間緊密連接,繼而再灌注的微泡在間歇式發(fā)射的超聲激勵(lì)下產(chǎn)生空化效應(yīng),進(jìn)一步開放間質(zhì)及腺上皮細(xì)胞間連接,進(jìn)而開放整個(gè)血-前列腺屏障,增強(qiáng)前列腺組織通透性。旨在提出一種全新的微侵襲性改變前列腺組織通透性的物理方法,嘗試解決經(jīng)血流途徑給藥前列腺組織內(nèi)藥物濃度較低的難題,為有效增加前列腺間質(zhì)及腺腔內(nèi)藥物濃度發(fā)揮更大的前列腺疾病治療效應(yīng)奠定前期的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.選用健康、成年雄性新西蘭白兔作為實(shí)

8、驗(yàn)動(dòng)物,隨機(jī)分為5組:微泡聯(lián)合超聲組(MBUS組)、微泡聯(lián)合超聲處理后留觀24hr組(MBUS24H組)、空白對(duì)照組(BC組)、單純微泡組(MB組)、單純超聲組(US組),分別給予相應(yīng)實(shí)驗(yàn)處理。
　　2.微泡介導(dǎo)超聲空化實(shí)驗(yàn)儀器和材料:微泡超聲空化治療儀為新橋醫(yī)院超聲科實(shí)驗(yàn)室專用,該儀器可以發(fā)射脈沖式、非聚焦式超聲能量,對(duì)微泡空化效率較高。本課題實(shí)驗(yàn)中采用頻率為831KHz,峰值聲壓為2.4MPa,平均聲強(qiáng)為0.3 W/cm2。脂

9、氟顯脂質(zhì)微泡由新橋醫(yī)院超聲科實(shí)驗(yàn)室研制,整體外觀為乳白色凝乳狀。作為空化核,其核心為全氟丙烷氣體,平均粒徑約為2μm,濃度約為9×1010/ml。本實(shí)驗(yàn)中采用的劑量為0.1ml/kg。
　　3.通過單位質(zhì)量前列腺EB含量測(cè)定和大體標(biāo)本EB滲出的觀察,探討微泡聯(lián)合超聲作用對(duì)前列腺通透性的影響。EB可作為微血管通透性增強(qiáng)的指示劑。通常情況下,EB在血液循環(huán)中與白蛋白穩(wěn)定結(jié)合形成 EB-白蛋白復(fù)合物,不能透過血管壁而進(jìn)入血管外。因此可通

10、過測(cè)定組織中EB含量,也即EB滲出量來評(píng)價(jià)組織通透性的變化。EB還可作為生物染色劑,如因通透性增強(qiáng),EB滲出可致血管外滲出區(qū)域被藍(lán)染。此外,HE染色光鏡觀察各組前列腺組織形態(tài)學(xué)改變。
　　4. EB作為示蹤劑,可被激發(fā)出明亮的紅色熒光,結(jié)合不同熒光標(biāo)記顯示前列腺組織微環(huán)境,使用激光共聚焦顯微鏡觀測(cè)微泡聯(lián)合超聲作用前列腺后EB的滲出,探討微泡介導(dǎo)超聲空化增強(qiáng)前列腺通透性及開放血-前列腺屏障的主要機(jī)制。
　　5.硝酸鑭示蹤透射電

11、子顯微鏡觀測(cè)微泡聯(lián)合超聲作用于前列腺的超微組織結(jié)構(gòu)改變,觀測(cè)指示通透性改變的示蹤劑-鑭顆粒的沉積,進(jìn)一步證實(shí)微泡介導(dǎo)超聲空化增強(qiáng)前列腺通透性及開放血-前列腺屏障可行性、有效性和可恢復(fù)性,分析其主要機(jī)制。
　　6. TUNEL細(xì)胞原位檢測(cè)分析BC組、MB組、US組、MBUS組、MBUS24H組細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。通過對(duì)各組前列腺上皮細(xì)胞凋亡指數(shù)的比較,分析不同實(shí)驗(yàn)處理對(duì)前列腺組織是否造成損傷及損傷程度比較,初步評(píng)估微泡聯(lián)合超聲作用于前

12、列腺的安全性。
　　7.數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件,各組單位質(zhì)量前列腺EB含量、凋亡指數(shù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示。梯度濃度系列EB溶液OD值和對(duì)應(yīng)濃度分析調(diào)用線性回歸分析程序。單因素方差分析用于各組的單位質(zhì)量前列腺EB含量、凋亡指數(shù)的比較和分析,P<0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,P<0.001具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果：
　　1.在 MBUS組中,單位質(zhì)量前列腺 EB含量為11.8876±

13、0.4140μg/g,明顯高于BC組、MB組、US組,表明微泡聯(lián)合超聲作用可以增強(qiáng)前列腺組織通透性。BC組、MB組、US組的單位質(zhì)量前列腺 EB含量分別為4.8664±0.4166μg/g、5.1967±0.2251μg/g、5.0776±0.1761μg/g,組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明單純微泡或單純超聲均對(duì)前列腺組織通透性無明顯影響。MBUS24H組的單位質(zhì)量前列腺EB含量為5.1773±0.3595μg/g,與BC組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異

14、,而與 MBUS組存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明微泡聯(lián)合超聲作用后24hr,增強(qiáng)的前列腺組織通透性可以復(fù)原,這也反映出微泡介導(dǎo)超聲空化增強(qiáng)前列腺通透性具有可恢復(fù)性。BC組、MB組、US組和MBUS24H組測(cè)得的少量的EB含量可能與相同灌注條件下前列腺微循環(huán)內(nèi) EB的少量殘留有關(guān),而 MBUS組單位質(zhì)量前列腺 EB含量與這些值相比較,明顯增多的部分應(yīng)與EB滲出有關(guān)。
　　2. MBUS組大體標(biāo)本整體觀察可見前列腺組織明顯藍(lán)染,藍(lán)染區(qū)分布

15、均勻;橫切面觀察可見腺實(shí)質(zhì)及包膜等結(jié)締組織藍(lán)染均勻。而 BC、MB、US、MBUS24H組大體標(biāo)本整體觀察可見前列腺組織無明顯藍(lán)染;橫切面顯示腺實(shí)質(zhì)均無明顯藍(lán)染,包膜等結(jié)締組織部分區(qū)域內(nèi)呈現(xiàn)不均勻的輕微藍(lán)染,均與 MBUS組的前列腺組織藍(lán)染存在肉眼可見的差異。
　　3. HE染色光鏡觀察可見微泡聯(lián)合超聲作用后的即刻和24hr,前列腺組織結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯改變;單獨(dú)給予微泡或超聲作用對(duì)前列腺組織結(jié)構(gòu)也無明顯影響。
　　4.在MBU

16、S組中,明亮的EB紅色熒光廣泛分布于血管外區(qū)域,包括間質(zhì)組織及腺上皮,并有均勻分布于腺上皮基底側(cè)及腺上皮細(xì)胞之間的趨勢(shì),甚至出現(xiàn)在腺上皮細(xì)胞內(nèi),這些與 BC、MB、US組存在明顯差異。在 BC、MB、US組中,前列腺組織血管腔中未見EB紅色熒光,這與EB隨灌注液離開微循環(huán)有關(guān);血管壁、間質(zhì)組織、腺上皮區(qū)域內(nèi)均未見明亮的EB紅色熒光,顯示EB未分布于這些部位。而在MBUS24H組中,血管腔、血管壁、間質(zhì)組織、腺上皮區(qū)域內(nèi)未顯示明亮 EB紅

17、色熒光,與BC、MB、US組相似,而與MBUS組存在明顯差異。
　　5.在MBUS組中,鑭顆粒不僅存在于血管腔內(nèi),可見黑色斑點(diǎn)狀高電子密度沉積物附著在血管內(nèi)皮細(xì)胞表面,還可以黑色線狀沉積于內(nèi)皮細(xì)胞連接之間,并可透過基底膜延伸入間質(zhì)內(nèi);在腺上皮基底側(cè)和腺上皮細(xì)胞之間也可見鑭顆粒呈黑色線狀高電子密度沉積。在BC、MB、US、MBUS24H組中,僅在血管腔內(nèi)可見鑭顆粒存在,血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)完整,內(nèi)皮細(xì)胞間連接緊密,基底膜完整,間質(zhì)內(nèi)、腺

18、上皮基底側(cè)和腺上皮細(xì)胞之間均未見鑭顆粒沉積。
　　6. TUNEL細(xì)胞原位檢測(cè)顯示單獨(dú)給予微泡或超聲輻照,不會(huì)引起腺上皮細(xì)胞凋亡增多;微泡聯(lián)合超聲作用前列腺,腺上皮細(xì)胞凋亡增多,但尚未對(duì)腺上皮組織造成明顯損傷,并在24hr后存在恢復(fù)趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　1.微泡聯(lián)合超聲作用于兔前列腺,可以增強(qiáng)前列腺通透性,經(jīng)24hr后這種改變可恢復(fù)至原有水平,而僅給予微泡靜注或超聲輻照對(duì)前列腺通透性未見明顯影響。這可能與微泡介導(dǎo)超聲

19、空化所致的聲孔效應(yīng)有關(guān),也即穩(wěn)態(tài)空化致聲孔效應(yīng)可以增強(qiáng)兔前列腺通透性,并且這種通透性的改變具有可恢復(fù)性。
　　2. EB示蹤激光共聚焦顯微鏡及硝酸鑭示蹤透射電子顯微鏡觀測(cè)證實(shí)微泡聯(lián)合超聲作用可以增強(qiáng)兔前列腺組織通透性,有效開放血-前列腺屏障,其主要機(jī)制為微泡介導(dǎo)超聲空化致聲孔效應(yīng)開放血管內(nèi)皮細(xì)胞及腺上皮細(xì)胞之間的緊密連接,導(dǎo)致EB或鑭顆粒這類示蹤劑可以透過血管壁進(jìn)入血管外間質(zhì)組織,并且能夠進(jìn)入腺上皮近基底側(cè),甚至進(jìn)入腺上皮細(xì)胞之間