葡萄籽原花青素抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子及RAGE表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一部分葡萄籽原花青素選擇性抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)背景隨著社會發(fā)展及人口老齡化，糖尿病發(fā)生率逐年增加，而其血管并發(fā)癥已成為糖尿病病人致死或致殘的主要原因。近年來研究顯示盡管強(qiáng)化降糖治療能改善部分糖尿病微血管并發(fā)癥的預(yù)后，但對糖尿病動脈粥樣硬化等大血管并發(fā)癥影響不大，而且血糖嚴(yán)格控制往往容易導(dǎo)致嚴(yán)重的低血糖反應(yīng)，病人難以耐受。進(jìn)一步的研究揭示，此“高血糖記憶現(xiàn)象”與糖尿病病人體內(nèi)積聚的糖基化終產(chǎn)物(Advanced gly

2、cation end products，AGEs)有關(guān)。 目的 大量證據(jù)證實(shí)AGEs與其受體RAGE相互作用在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生和發(fā)展中起了至關(guān)重要的作用，AGEs與RAGE結(jié)合能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，活性氧簇(ROS)產(chǎn)生增加，增加的ROS反過來激活一系列復(fù)雜的信號傳導(dǎo)途徑及隨后的轉(zhuǎn)錄因子NF-κB等，后者進(jìn)一步促進(jìn)多種基因的表達(dá)，其中大多數(shù)是與炎癥、免疫和動脈粥樣硬化相關(guān)的，如黏附分子、趨化蛋白、生長因子、組織因子

3、等。葡萄籽原花青素(Grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE)是從葡萄籽中提取的多酚類化合物，擁有很強(qiáng)的抗氧化活性。本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells，HUVEC)為研究對象，觀察GSPE是否能通過抗氧化機(jī)制抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子表達(dá)。方法牛血清白蛋白(BSA)與高濃度的葡萄糖在37℃下孵育12周以制備糖基

4、化終產(chǎn)物AGE-BSA。激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀評價細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞表面VCAM-1及ICAM-1蛋白表達(dá)，RT-PCR檢測細(xì)胞內(nèi)VCAM-1及ICAM-1 mRNA水平。首先用200μg/ml AGE-BSA與內(nèi)皮細(xì)胞孵育不同時間，觀察AGEs對內(nèi)皮細(xì)胞ROS產(chǎn)生及VCAM-1、ICAM-1蛋白及基因表達(dá)的時間刺激強(qiáng)度。接下來，先用不同濃度(5、15、25μg/ml)GSPE預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞4h，然后加用200μ

5、g/ml AGE-BSA刺激內(nèi)皮細(xì)胞不同時間，觀察GSPE是否能抑制細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，進(jìn)而抑制VCAM-1及ICAM-1蛋白及基因的表達(dá)。 結(jié)果 1．200 μg/ml AGE-BSA與內(nèi)皮細(xì)胞孵育3 h時VCAM-1及ICAM-1蛋白表達(dá)開始增強(qiáng)，12 h時達(dá)到高峰，24 h表達(dá)降低，但仍未到達(dá)基礎(chǔ)水平。對照組未處理的內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1及ICAM-1蛋白表達(dá)很低，未糖基化修飾的BSA與25μg/mlGSPE均沒有影響

6、VCAM-1及ICAM-1蛋白表達(dá)。而不同濃度(5、15及25μg/ml)GSPE與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵育4 h顯著抑制200μg/ml AGE-BSA刺激的VCAM-1蛋白表達(dá)，并呈劑量依賴性，但卻沒有影響增高的ICAM-1蛋白水平。在不同劑量組，VCAM-1蛋白表達(dá)分別降低到79.90﹪±8.49﹪(5μg/ml GSPE組)、52.09﹪±5.19﹪(15μg/ml GSPE組)、20.53﹪±5.21﹪(25μg/ml GSPE組)(與

7、AGE-BSA誘導(dǎo)組相比，P<0.01)。 2．AGE-BSA處理內(nèi)皮細(xì)胞2 h時VCAM-1及ICAM-1 mRNA水平均開始增加，6 h時達(dá)到高峰，12 h時有所下降，但未接近基礎(chǔ)水平。不同劑量(5、15及25μg/ml)GSPE與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵育4 h，再用200μg/ml AGE-BSA刺激6 h，與VCAM-1及ICAM-1表面蛋白表達(dá)相一致，GSPE顯著降低了VCAM-1 mRNA水平，并呈劑量依賴性，而增強(qiáng)的ICAM

8、-1 mRNA水平卻沒有改變。不同劑量的GSPE分別將VCAM-1mRNA水平從0.388±0.035(AGE-BSA誘導(dǎo)組)降低到0.275±0.015(5μg/ml GSPE組)、0.146±0.031(15μg/ml GSPE組)、0.077±0.009(25μg/ml GSPE組)(與AGE-BSA誘導(dǎo)組相比，P<0.01)。 3.激光共聚焦顯微鏡檢測結(jié)果顯示，AGE-BSA與內(nèi)皮細(xì)胞孵育0 min時細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度較弱，ROS產(chǎn)

9、生較低，15 min時ROS產(chǎn)生增加，30 min時達(dá)到高峰，以后逐漸下降，60 min時接近基礎(chǔ)水平。5、15、25μg/ml的GSPE與HUVEC預(yù)孵育4 h明顯抑制了200μg/ml AGE-BSA誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生，抑制作用隨GSPE劑量的增加而增強(qiáng)(AGE-BSA誘導(dǎo)組：3.12±0.31、5 μg/ml GSPE組：2.36±0.34、15 μg/ml GSPE組：1.95±0.41、25 μg/ml GSPE組：1.14±0

10、.23，與AGE-BSA誘導(dǎo)組相比，P<0.01)。流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS也得出相似的結(jié)果。 結(jié)論 . 1.體外制備的AGE—BSA與內(nèi)皮細(xì)胞孵育能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，ROS產(chǎn)生增加，進(jìn)而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞VCAIVl-1及：ICAM-1蛋白與mRNA表達(dá)。 2.不同劑量的GSPE預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞選擇性抑制了AGE—BSA誘導(dǎo)的VCAM—l蛋白及mRNA表達(dá)，并呈劑量依賴性，但沒有影響ICAM-1水平。 3.

11、通過其抗氧化特性，GSPE以劑量依賴的方式抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，。這可能涉及GSPE對AGEs誘導(dǎo)的黏附分子表達(dá)的選擇性抑制作用。 4.GSPE能選擇性抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞VCAM-1的表達(dá)，因此，GSPE有助于防止糖尿病早期血管病變的發(fā)生，這將為GSPE在糖尿病病人中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。 第二部分葡萄籽原花青素對AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞RAGE基因表達(dá)的影響背景研究證實(shí)RAGE是-信號傳導(dǎo)受體，屬于免疫球蛋白超家

12、族成員，是介導(dǎo)AGEs致糖尿病血管病變的主要結(jié)合蛋白。RAGE與AGEs結(jié)合能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，激活下游信號傳導(dǎo)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)等。多種細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞、單核細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及淋巴細(xì)胞等均能表達(dá)RAGE，正常情況下表達(dá)量很低，但在某些病理?xiàng)l件下表達(dá)增加并能持續(xù)數(shù)年，且AGEs與RAGE表達(dá)之間存在正反饋調(diào)節(jié)機(jī)制，在血管系統(tǒng)AGEs增多的病變部位往往伴隨著RAGE表達(dá)的增加，這種正反饋調(diào)節(jié)被認(rèn)為能促進(jìn)并延長RAGE與配體的致病作用。另外，內(nèi)

13、皮細(xì)胞表面RAGE還可作為黏附受體與白細(xì)胞β 2整合素作用，直接參與血管壁炎癥細(xì)胞的募集。因此，限制RAGE表達(dá)將有助于抑制AGEs-RAGE系統(tǒng)的致病作用，并能阻斷其惡性循環(huán)。目的葡萄籽原花青素(GSPE)是從葡萄籽中提取的天然抗氧化物質(zhì)。本研究以體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，觀察GSPE是否能抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞RAGE基因表達(dá)。 方法 激光共聚焦顯微鏡及流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的改變，RT-PCR測

14、定RAGE mRNA水平。首先用200 μg/ml AGE-BSA與內(nèi)皮細(xì)胞孵育不同時間，觀察AGEs對內(nèi)皮細(xì)胞RAGE基因表達(dá)的刺激作用，然后用不同濃度(5、15及25μg/ml)GSPE與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵育4 h，再用200 μg/ml AGE-BSA刺激內(nèi)皮細(xì)胞，觀察GSPE是否抑制AGEs誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞RAGE基因表達(dá)。 結(jié)果 1.200μg/ml AGE-BSA與內(nèi)皮細(xì)胞孵育2 h時RAGE mRNA的表達(dá)有增加趨

15、勢，4 h時表達(dá)明顯增強(qiáng)，6 h時達(dá)到峰值，以后RAGE mRNA表達(dá)逐漸降低，但12 h時未接近正常水平。BSA及GSPE單獨(dú)沒有影響細(xì)胞內(nèi)RAGE mRNA的水平。不同劑量GSPE與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵育4 h能以劑量依賴的方式抑制AGE.BSA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)，5、15、25μg/ml GSPE降低細(xì)胞內(nèi)RAGEmRNA水平分別從1.12±0.15(AGE.BSA誘導(dǎo)組)到0.75±0.11、0.48±0.08、0.2

16、7±0.10(與AGE-BSA誘導(dǎo)組相比，P<0.01)。 2.激光共聚焦顯微鏡測定結(jié)果顯示，與正常對照組相比較，BSA及GSPE單獨(dú)沒有增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生，同樣的，GSPE與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵育4h以劑量依賴的方式抑制了細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。細(xì)胞內(nèi)ROS水平分別從3.02±0.29(AGE-BSA誘導(dǎo)組)降低到2.49+0.42(5μg/ml GSPE組)、1.95±0.24(15 μdmlGSPE組)、1.26±0.41(25 μ

17、g/ml GSPE組)(與AGE-BSA誘導(dǎo)組相比，P<0.01)。另外，流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)ROS也得出相一致的結(jié)果。 結(jié)論 1.體外制備的AGE-BSA能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，ROS產(chǎn)生增加，并能導(dǎo)致RAGE mRNA表達(dá)增強(qiáng)，未修飾的BSA和GSPE單獨(dú)沒有影響細(xì)胞內(nèi)ROS及RAGE mRNA水平。 2．不同劑量GSPE與內(nèi)皮細(xì)胞預(yù)孵育明顯抑制AGE-BSA刺激的內(nèi)皮細(xì)胞RAGE mRNA表達(dá)，并呈劑量依賴性，這有助