葡萄籽原花青素對結(jié)腸癌細(xì)胞的抑制作用及其機制的研究.pdf

1、目的:結(jié)腸癌(colorectal cancer，CRC)的發(fā)病率和死亡率很高，研究發(fā)現(xiàn)飲食結(jié)構(gòu)與癌癥的發(fā)生密切相關(guān)，其中抗氧化劑在抑制腫瘤發(fā)生過程具有重要的作用。作為重要的抗氧化物質(zhì)，原花青素在人們?nèi)粘ｏ嬍辰Y(jié)構(gòu)中占有較高的比例，是藥食同源的典型代表。原花青素是一類常見的多酚類物質(zhì)，研究表明這類物質(zhì)具有腫瘤防治功效，并且對人體毒副作用較低，提示其在腫瘤預(yù)防和治療中具有重要的價值。本研究利用葡萄籽原花青素（Grape Seed Proan

2、thocyanidins，GSPs）處理結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480和SW620（這兩個細(xì)胞系來自于同一患者，其中SW480具有低轉(zhuǎn)移性特點，而SW620具有高轉(zhuǎn)移性的特點），檢測其對細(xì)胞的生物學(xué)特征（細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞EMT、細(xì)胞外泌體）的影響，隨后采用二代測序技術(shù)，在兩種細(xì)胞株中鑒定GSPs調(diào)控的基因，差異表達基因隨后進行KEGG Pathway富集分析，探討GSPs對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和SW620的作用分子機

3、制，為結(jié)腸癌的預(yù)防治療提供新的途徑與實驗依據(jù)。
　　方法:1.細(xì)胞生物學(xué)特征的鑒定:(1)細(xì)胞形態(tài)觀察，采用GSPs處理SW480和SW620細(xì)胞，觀察其對細(xì)胞形態(tài)的影響;(2)細(xì)胞增殖能力檢測，采用MTT法檢測GSPs對細(xì)胞存活率的影響;(3)細(xì)胞周期和凋亡檢測，利用流式細(xì)胞儀檢測GSPs對兩種細(xì)胞的影響。2.分子生物學(xué)鑒定:(1)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，E

4、MT)相關(guān)的分子的鑒定，分別采用Western blotting以及實時定量PCR(Q-PCR)方法分別檢測細(xì)胞本體以及外泌體中相關(guān)分子的表達，評估GSPs對EMT事件的影響。(2)兩種細(xì)胞中GSPs調(diào)控基因的鑒定，GSPs分別處理兩種細(xì)胞，利用二代測序技術(shù)檢測細(xì)胞處理前后的轉(zhuǎn)錄組差異，通過生物信息學(xué)的分析，篩選出差異表達的基因，并對這些基因進行GO功能以及KEGG Pathway富集分析。(3)部分靶基因的驗證，結(jié)合數(shù)據(jù)分析的結(jié)果，利

5、用Q-PCR和Western blotting法分別檢測GSPs處理前后信號通路相關(guān)分子的mRNA和蛋白表達水平，進而從機制上闡明GSPs對SW480和SW620的抑制作用。
　　結(jié)果:GSPs作用于SW480和SW620細(xì)胞后，形態(tài)均發(fā)生明顯改變，細(xì)胞發(fā)生膨脹，多呈圓形，周緣毛糙不規(guī)則。在短期時間(24h)內(nèi)GSPs對SW480和SW620細(xì)胞的增殖具有促進作用，而在處理更長時間后(48h、72h)，則具有抑制作用，細(xì)胞的存活率

6、顯著下降。GSPs可引起SW480和SW620細(xì)胞周期在G0/G1期發(fā)生阻滯，而且能夠顯著促進細(xì)胞的凋亡。GSPs對SW480和SW620細(xì)胞EMT也具有抑制作用，對應(yīng)的分子變化顯示，GSPs處理后兩細(xì)胞的胞體以及外泌體里的E-cadherin的表達水平均升高，同時還發(fā)現(xiàn)外泌體中miRNA的表達量降低。差異表達基因篩選顯示，超過200個差異基因涉及到Akt的通路，進一步對Akt通路相關(guān)的分子檢測發(fā)現(xiàn)，GSPs處理不僅降低Akt的表達水平

7、，同時也可抑制其磷酸化，同時可上調(diào)Bad、Bax、caspase3和caspase9以及下調(diào)Bcl-2、Cyclin D1和CDK4
　　結(jié)論:本研究通過細(xì)胞學(xué)特征的觀察，發(fā)現(xiàn)GSPs對結(jié)腸癌細(xì)胞SW480和SW620的生物學(xué)特征有顯著的影響，如:抑制細(xì)胞的增殖、EMT能力，造成細(xì)胞在G0/G1期發(fā)生阻滯，促進細(xì)胞凋亡。機制研究顯示，GSPs可導(dǎo)致兩種細(xì)胞多種基因表達的差異，其中Akt通路相關(guān)基因的改變具有一定的代表性，進一步對該