葡萄籽原花青素對(duì)牙齦卟啉單胞菌LPS及BBF影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的:
　　近年來(lái)，中醫(yī)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。很多學(xué)者已發(fā)現(xiàn)中醫(yī)在治療口腔疾病方面的可行性。中草藥來(lái)源于天然植物，副作用小，不易使細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性。葡萄籽原花青素(GSPE)是一種純天然的抗氧化劑，具有較強(qiáng)的抑菌作用?，F(xiàn)研究表明牙齦卟啉單胞菌在牙髓、牙周疾病以及口臭的發(fā)生、發(fā)展中都發(fā)揮著重要作用。牙齦卟啉單胞菌是G-厭氧短桿菌，其分泌的內(nèi)毒素(LPS)等毒力因子以及形成的生物膜(BBF)能夠逃避宿主的免疫防御系統(tǒng)，

2、破壞宿主牙周組織。目前GSPE對(duì)牙齦卟啉單胞菌抑制作用的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)GSPE對(duì)牙齦卟啉單胞菌的內(nèi)毒素及生物膜的影響作用研究，探索GSPE在治療口腔疾病方面的可行性，為研究開(kāi)發(fā)預(yù)防牙周疾病以及口臭等方面的高效低毒的藥物及相關(guān)性食品奠定理論基礎(chǔ)。
　　材料和方法:
　　實(shí)驗(yàn)一:GSPE對(duì)牙齦卟啉單胞菌的最低抑菌濃度
　　將牙齦卟啉單胞菌凍干菌在胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)內(nèi)復(fù)蘇，增菌以及繼代培養(yǎng)，挑取培養(yǎng)

3、好的菌株，用PBS緩沖液將菌液校正至0.5麥?zhǔn)媳葷針?biāo)準(zhǔn)的菌液備用。將GSPE用無(wú)菌去離子水配制原花青素溶液128mg/ml的原液，然后倍比稀釋配制不同濃度，取各濃度藥液1.50ml與50℃TSB瓊脂培養(yǎng)基13.50ml混勻，傾注平板使其終濃度為12.8mg/ml，6.4mg/ml，3.2mg/ml，1.6mg/ml，0.8mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml。分別取2ul菌液在不同濃度的平

4、板上點(diǎn)種。37℃厭氧培養(yǎng)48h。以肉眼所見(jiàn)平板上無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)的最低濃度為GSPE的最低抑菌濃度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次
　　實(shí)驗(yàn)二:采用鱟試驗(yàn)測(cè)定GSPE對(duì)P.g產(chǎn)生LPS的影響
　　在無(wú)熱源管中，分別配制2mlGSPE溶液終濃度為0.8mg/ml，0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml，0.025 mg/ml的TSB液體培養(yǎng)基，以及不含GSPE只有2mlTSB液體培養(yǎng)基的空白對(duì)照組，各組分別加入細(xì)菌混

5、懸液(1×106cfu/ml)0.1ml，37℃厭氧培養(yǎng)72h。分別吸取7組不同實(shí)驗(yàn)樣品0.2ml加入鱟試劑中，振蕩后，置檢測(cè)儀上檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　實(shí)驗(yàn)三:GSPE對(duì)牙齦卟啉單胞菌生物膜的影響
　　將配制好的菌液（1×106cfu/ml）分別加入96孔板中，每孔0.1ml。37℃恒溫厭氧培養(yǎng)5天后96孔板內(nèi)壁附著生物膜。將96孔板中菌液傾出。96孔板分四組，1-3列為實(shí)驗(yàn)組，自A-F行依次加入3.2mg/ml-0.1

6、 mg/ml梯度濃度的GSPE溶液。4-6為陽(yáng)性對(duì)照組加入0.14％-0.0045％梯度濃度的次氯酸鈉，7-9為陰性對(duì)照組，10-12為背景對(duì)照組，只加藥液。培養(yǎng)24h后用PBS溶液輕柔清洗三次，結(jié)晶紫染色30分鐘后倒出清洗，脫氧膽酸鈉脫色30min后，置酶標(biāo)儀測(cè)OD值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)六次。
　　結(jié)果:
　　1、肉眼可見(jiàn)，GSPE溶液濃度為0.05mg/ml，0.1mg/ml，0.2mg/ml，0.4mg/ml的TSB瓊脂培養(yǎng)基上

7、都長(zhǎng)有少量細(xì)菌，而濃度為0.8mg/ml，1.6mg/ml，3.2mg/ml，6.4mg/ml，12.8mg/ml的TSB瓊脂培養(yǎng)基上均無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，故可認(rèn)為0.8mg/mlGSPE溶液為最低抑菌濃度。
　　2、鱟實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GSPE濃度為0.4mg/ml，0.2mg/ml，0.1 mg/ml，0.05mg/ml，0.025mg/ml時(shí)反應(yīng)結(jié)果呈陽(yáng)性，濃度為0.8mg/ml時(shí)反應(yīng)結(jié)果呈陰性。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示在0.05-0.4mg/ml

8、范圍內(nèi)隨著GSPE濃度的升高，對(duì)LPS抑制作用增強(qiáng)。
　　3、經(jīng)過(guò)GSPE藥物及次氯酸鈉作用后的吸光值比沒(méi)有藥物作用的明顯減小，計(jì)算后的生物膜抑制率隨藥物濃度遞增而增加。與次氯酸鈉比較，GSPE對(duì)生物膜的清除作用不如次氯酸鈉好。
　　結(jié)論:
　　1.GSPE對(duì)牙齦卟啉單胞菌有顯著抑制作用，最低抑菌濃度為0.8mg/ml。
　　2、隨著GSPE濃度的升高，菌液中LPS含量越來(lái)越少，在0.05-0.4mg/ml濃度范