起博電流及HCN通道在心房顫動(dòng)的機(jī)制研究及伊伐布雷定對(duì)心房顫動(dòng)的干預(yù)研究.pdf

1、第一部分、轉(zhuǎn)基因心房顫動(dòng)小鼠和野生型小鼠心房肌細(xì)胞的電生理學(xué)比較
　　目的：心房顫動(dòng)（房顫）是臨床上最常見(jiàn)的心律失常之一，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，目前尚無(wú)確定的闡明其病理生理機(jī)制，本研究采用自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究小鼠心房肌細(xì)胞相關(guān)離子通道電流的改變，為進(jìn)一步闡明房顫的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：本研究實(shí)驗(yàn)組為自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型，對(duì)照組為同齡野生型普通C57BL/6小鼠;采用VisualSonics Vevo7

2、70高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)對(duì)小鼠行心臟超聲檢測(cè);采用PCLAB-UE生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄小鼠的心電圖數(shù)據(jù);采用改良的Langendorff灌流裝置、二步消化法來(lái)急性分離小鼠心房肌細(xì)胞;采用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄動(dòng)作電位和離子通道電流（瞬時(shí)外向鉀電流Ito、內(nèi)向整流鉀通道IK1和起搏電流If）。
　　結(jié)果：心臟超聲數(shù)據(jù)顯示，野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠的心臟結(jié)構(gòu)和功能未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。體表心電圖數(shù)據(jù)顯示，相比于野生型小鼠，轉(zhuǎn)基因小鼠

3、基礎(chǔ)心率偏慢（轉(zhuǎn)基因小鼠:391±61次/分;野生型小鼠:436±50次/分，p=0.048），轉(zhuǎn)基因小鼠QT間期較野生型小鼠的偏長(zhǎng)（42.3±8.6ms比34.2±8.6ms，p=0.02），但用心率校正后得到QTc，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（34±6.8ms比29.1±7.1ms，p=0.076）。膜片鉗記錄結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠的單個(gè)心房肌細(xì)胞動(dòng)作電位AP近似于三角形，其復(fù)極較快，二者靜息電位未見(jiàn)明顯差異（轉(zhuǎn)基因小鼠:-67.9

4、±5.0mV;野生型小鼠-65.3±4.2mV，p=0.350），APD未見(jiàn)明顯差異（59.1±14.3ms比46.0±12ms，p=0.082），其中APD20（4.8±0.5ms比4.9±0.8ms，p=0.837）、APD50(7.3±4.6ms比9.6±4.5ms，p=0.370)、APD90（29.2±8.8ms比25.6±8.2ms，p=0.437）比較均未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　在離子通道電流方面:Ito電流，轉(zhuǎn)基因小鼠

5、的峰值較野生型小鼠的峰值稍低，從-30mV～+70mV二者電流密度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在70mV的電流密度（野生型小鼠:12.2±0.6pA/pF;轉(zhuǎn)基因小鼠11.0±0.7pA/pF，p=0.036），但在通道動(dòng)力學(xué)方面，即穩(wěn)態(tài)啟動(dòng)曲線在二者并無(wú)差異;IK1電流，野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌細(xì)胞的未見(jiàn)明顯差異;If電流，轉(zhuǎn)基因小鼠的電流峰值較野生型小鼠的電流幅度明顯增大，尾電流（-40mV引出）也明顯增大，從-70mV～-170mV二者電

6、流密度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在-170mV的電流密度（野生型小鼠:-26.9±3.0pA/pF;轉(zhuǎn)基因小鼠:-39.6±4.6pA/pF，p＜0.001），轉(zhuǎn)基因小鼠的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯右移，Boltzmann方程擬合得到半激活電壓(V1/2)和斜率因子k，野生型小鼠V1/2為-128.2±1.65mV，而轉(zhuǎn)基因小鼠為-109.45±1.35mV(p＜0.05)，野生型和轉(zhuǎn)基因小鼠的k分別為13.91±0.98mV和14.41±0.78mV(p

7、=0.58)。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)基因房顫小鼠和野生型小鼠相比，二者的心臟結(jié)構(gòu)和功能無(wú)明顯差異;轉(zhuǎn)基因房顫小鼠比野生型小鼠的心率稍慢，相應(yīng)的QT間期略長(zhǎng)，但經(jīng)心率校正后的QTc在二者間并無(wú)差異;轉(zhuǎn)基因房顫小鼠和野生型小鼠的心房肌細(xì)胞的電生理特性即動(dòng)作電位的特點(diǎn)未發(fā)現(xiàn)明顯差異;離子通道電流方面，轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌細(xì)胞的It0電流較野生型小鼠的略減弱，但通道動(dòng)力學(xué)方面并無(wú)差異;IK1電流在二者的心房肌細(xì)胞中無(wú)差異;轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌細(xì)胞

8、的If電流密度明顯大于野生型小鼠，且心房肌細(xì)胞的If電流更容易激活，提示起搏電流可能參與了房顫的某種發(fā)生機(jī)制。
　　第二部分、轉(zhuǎn)基因心房顫動(dòng)小鼠和野生型小鼠心房肌電流改變的分子機(jī)制比較
　　目的：心房顫動(dòng)（簡(jiǎn)稱房顫）的電生理特性改變的基礎(chǔ)在于心房肌細(xì)胞的離子通道改變，離子通道蛋白是房顫的關(guān)鍵分子底物。本研究采用自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型，研究小鼠心房肌組織相關(guān)離子通道表達(dá)的改變，為闡明房顫的發(fā)病機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　方

9、法：本研究實(shí)驗(yàn)組為自發(fā)性房顫轉(zhuǎn)基因小鼠模型，對(duì)照組為同齡野生型普通C57BL/6小鼠;采用RT-PCR方法檢測(cè)小鼠心房肌組織HCN通道m(xù)RNA(HCN2和HCN4)改變情況;采用Western-Blot方法檢測(cè)小鼠心房肌組織HCN通道蛋白（HCN2和HCN4）及Kv4蛋白（Kv4.2和Kv4.3）的改變情況。
　　結(jié)果：轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌組織的HCN2 mRNA相對(duì)表達(dá)(HCN2/GAPDH)明顯高于野生型小鼠（1.10±0.4

10、0，N=6比0.36±0.17，N=6，p＜0.01）;同樣，HCN4 mRNA的在轉(zhuǎn)基因小鼠的心房肌組織中表達(dá)顯著高于野生型小鼠（1.48±0.63，N=6比0.52±0.11，N=6，p＜0.01）;WB結(jié)果顯示HCN2蛋白在野生型小鼠和轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織中差異不明顯，而HCN4蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠中表達(dá)明顯高于野生型普通小鼠，經(jīng)過(guò)蛋白條帶灰度值分析，得出轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織HCN2的相對(duì)表達(dá)量為0.034±0.010，野生型小鼠為0

11、.035±0.017(p=1.00); HCN4蛋白的相對(duì)表達(dá)量二者中有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（0.088±0.054比0.014±0.009，p=0.029）。Kv4.2和Kv4.3在野生型小鼠的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠，Kv4.2蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達(dá)明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠（0.68±0.26比0.27±0.22，N=6，p=0.015），同樣，Kv4.3蛋白在野生型小鼠心房肌組織中的表達(dá)亦明顯高于轉(zhuǎn)基因小鼠(1.04±0.13比0.

12、23±0.08，N=6，p=0.002)。
　　結(jié)論：轉(zhuǎn)基因房顫小鼠心房肌組織的HCN2和HCN4 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著高于野生型小鼠;轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織的HCN4蛋白水平相對(duì)表達(dá)顯著高于野生型小鼠;轉(zhuǎn)基因小鼠心房肌組織的Kv4.2和Kv4.3蛋白水平相對(duì)表達(dá)顯著低于野生型小鼠。
　　第三部分、伊伐布雷定對(duì)心房顫動(dòng)的預(yù)防作用及對(duì)起搏電流和HCN通道的影響
　　目的：近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)起搏電流參與了房顫的發(fā)生發(fā)展病理生理

13、機(jī)制，作為起搏電流的特異性阻滯劑一伊伐布雷定，目前被證實(shí)通過(guò)抑制起搏電流進(jìn)而減少某些心律失常的發(fā)生，本研究擬探討伊伐布雷定在心房顫動(dòng)的預(yù)防和治療方面的作用以及對(duì)起搏電流及HCN通道的影響，為房顫的發(fā)病機(jī)制和防治打下理論基礎(chǔ)。
　　方法：本研究將5-6月齡大小、尚未發(fā)生房顫的轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為用藥組（15只）和對(duì)照組（15只），同齡的野生型C57B1/6小鼠也隨機(jī)分為用藥組（15只）和對(duì)照組（15只）;將伊伐布雷定（7mg/kg/天

14、，加入飲用水）喂養(yǎng)用藥組小鼠，持續(xù)時(shí)間為4個(gè)月，平均每2周行心電監(jiān)測(cè)，觀察心率變化情況及房顫的發(fā)生情況。
　　本研究采用改良的Langendorff灌流裝置、二步消化法來(lái)急性分離小鼠心房肌細(xì)胞;采用VisualSonics Vevo770高分辨率小動(dòng)物超聲系統(tǒng)對(duì)小鼠行心臟超聲檢測(cè);采用PCLAB-UE生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)記錄小鼠的心電圖數(shù)據(jù);采用標(biāo)準(zhǔn)的全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄動(dòng)作電位和離子通道電流;本研究采用RT-PCR方法檢測(cè)小鼠心

15、房肌組織HCN通道改變情況;采用Western-Blot方法檢測(cè)小鼠心房肌組織HCN通道蛋白改變情況。
　　結(jié)果：經(jīng)過(guò)4個(gè)月的伊伐布雷定治療后，轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠陣發(fā)性房顫的發(fā)生率對(duì)照組小鼠明顯降低（用藥組:41％比對(duì)照組:16.7％，p＜0.01），野生型小鼠未記錄到房顫發(fā)作。在體表心電數(shù)據(jù)方面，轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠心率較對(duì)照組下降了約13％（用藥組:392±61;對(duì)照組:342±57次/分，p=0.042），對(duì)應(yīng)的QT間期和心率校正

16、后的QT間期(QTc)均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;野生型用藥組小鼠較對(duì)照組下降了約11％（用藥組436±51次/分比對(duì)照組:387±32次/分，p=0.044），其對(duì)應(yīng)的QT間期有所延長(zhǎng)，但QTc無(wú)明顯差異。在心臟超聲數(shù)據(jù)方面，轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠左室收縮末期內(nèi)徑較對(duì)照組小鼠有所縮短，射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)均有增加;野生型小鼠用藥組和對(duì)照組數(shù)據(jù)未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。膜片鉗單細(xì)胞動(dòng)作電位記錄方面，轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠心房肌細(xì)胞靜息電位、APD20、AP

17、D50及APD90差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;同樣，野生型用藥組小鼠和對(duì)照組小鼠心房肌細(xì)胞上述指標(biāo)亦均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在起搏電流記錄方面，轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠心房肌起搏電流引出率較對(duì)照組明顯減低（46.7％比75.4％，p＜0.01），野生型用藥組小鼠和對(duì)照組未見(jiàn)差異(43.3％比49.2％，p=0.78);轉(zhuǎn)基因小鼠用藥組和對(duì)照組起搏電流比較，用藥組小鼠的電流幅度較對(duì)照組小鼠的電流幅度明顯減弱，尾電流也明顯減小，用藥組小鼠的I-V曲線明顯上移，從-

18、80mV～-170mV二者電流密度均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（在-170mV的電流密度，用藥組:-17.7±3.0pA/pF，對(duì)照組:-39.6±4.6pA/pF，p＜0.001），用藥組小鼠的穩(wěn)態(tài)激活曲線明顯左移，二者的半激活電壓(V1/2)（用藥組:-124.4±3.25mV，對(duì)照組:-109.45±0.72mV，p＜0.001）和斜率因子k(22.58±2.75mV比14.40±0.78mV，p＜0.001)均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。分子生物學(xué)方面

19、，伊伐布雷定應(yīng)用后使得轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠心房肌HCN2 mRNA相對(duì)表達(dá)下降了50％(用藥組:0.55±0.34比對(duì)照組:1.10±0.40，p=0.029)，同樣HCN4mRNA相對(duì)表達(dá)量下降了約63.5％(0.54±0.41比1.48±0.63，p=0.012);在野生型小鼠中用藥組和對(duì)照組心房肌組織的HCN2和HCN4 mRNA相對(duì)表達(dá)量均未見(jiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在應(yīng)用伊伐布雷定口服治療4個(gè)月后，轉(zhuǎn)基因用藥組小鼠和野生型用藥組小鼠心房肌

20、組織HCN2(0.02±0.0078比0.0097±0.006)及HCN4蛋白相對(duì)表達(dá)量(0.18±0.10比0.22±0.15)差異亦未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：長(zhǎng)期伊伐布雷定治療能顯著降低尚未進(jìn)展為房顫的轉(zhuǎn)基因房小鼠的房顫發(fā)生率，對(duì)房顫的發(fā)生有一定的預(yù)防作用;伊伐布雷定治療能逆轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)基因房顫小鼠的心臟電生理改變，這主要是降低了起搏電流的“功能獲得”作用，進(jìn)而減弱了其自發(fā)性電活動(dòng)而起到抗心律失常作用;伊伐布雷定的抗心律失常作用不依