NK細(xì)胞功能與HCV感染及抗病毒治療轉(zhuǎn)歸的研究.pdf

1、目的：
　　 1.研究NK 細(xì)胞功能與HCV感染及抗病毒治療后不同轉(zhuǎn)歸間的關(guān)系；
　　 2.比較丙型肝炎患者NK細(xì)胞功能的體內(nèi)外差異；
　　 3.探討丙肝患者抗病毒治療過(guò)程中NK 細(xì)胞功能的動(dòng)態(tài)變化及其與病毒載量、基因型的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.病例：（1）慢性HCV 感染患者49例，其中未治療者30例，應(yīng)用IFN-α聯(lián)合利巴韋林治療者19例（2）感染HCV后自發(fā)清除病毒者5例（3）經(jīng)過(guò)抗

2、病毒治療后持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答患者18例（4）經(jīng)過(guò)抗病毒治療后非持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答患者17例（5）
　　 健康對(duì)照18例。已排除其它病毒合并感染，取外周肝素鈉抗凝血備檢。
　　 2．采用ELISA 檢測(cè)HCV 抗體，序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)（SSP-PCR）方法檢測(cè)HCV基因分型。應(yīng)用Real time-PCR 定量檢測(cè)HCV-RNA 水平，包括未治療、治療后持續(xù)或非持續(xù)應(yīng)答及自發(fā)恢復(fù)的丙肝患者在入組時(shí)；接受治療的病人在治療前及

3、治療4周、12周、24周時(shí)間點(diǎn)。
　　 3．采用易得人淋巴細(xì)胞分離管分離出外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），利用CFSE/PI染色方法檢測(cè)NK 細(xì)胞對(duì)K562 細(xì)胞的殺傷活性。
　　 4．流式染色技術(shù)檢測(cè)NK 細(xì)胞及其亞型的頻率，NK 細(xì)胞表面激活及抑制性受體的頻率，細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ及TNF-α的分泌情況。
　　 5．將一部分健康對(duì)照及慢性丙肝患者分離出的PBMC 加入細(xì)胞因子（rh IL-2

4、及rh IL-15）進(jìn)行體外培養(yǎng),72h后檢測(cè)NK 細(xì)胞表面受體及分泌細(xì)胞因子的變化。
　　 6.Flowjo Software 對(duì)流式圖進(jìn)行處理，SPSS13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，p值<0.05認(rèn)為有顯著差異性。
　　 結(jié)果：
　　 1.慢性HCV 感染及治療后不同轉(zhuǎn)歸患者組間NK 細(xì)胞、亞型、表面受體、殺傷活性及分泌細(xì)胞因子頻率的比較：
　　 （1）慢性丙肝患者外周血NK 細(xì)胞殺傷活性，表達(dá)受體N

5、KG2D及分泌細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α頻率明顯低于健康對(duì)照組（p＜0.01），受體NKG2C顯著低于自發(fā)恢復(fù)組（p＜0.01）；受體NKp30，NKp44及NKG2A 顯著低于持續(xù)應(yīng)答組（p＜0.05）。
　　 （2）與治療后持續(xù)應(yīng)答患者相比，非持續(xù)應(yīng)答者NK細(xì)胞殺傷活性顯著減低（p＜0.01）；此外其殺傷活性，受體NKG2D及分泌細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α頻率明顯低于健康對(duì)照，受體NKG2A 則相反（p＜0.05）。

6、
　　 （3）持續(xù)應(yīng)答患者NK 細(xì)胞表面活化性受體NKp46,NKp30,NKp44,NKG2D及NKG2A 與較非持續(xù)應(yīng)答者高，分泌細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α能力亦較強(qiáng)，但沒(méi)有達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　 （4）自發(fā)恢復(fù)的HCV 感染者外周血NK 細(xì)胞、受體NKp46、NKG2C及分泌細(xì)胞因子TNF-α頻率高于非持續(xù)應(yīng)答患者（p＜0.05）。
　　 2.體外培養(yǎng)后，慢性HCV 感染患者NK 細(xì)胞頻率降低，顯著低于

7、健康對(duì)照組培養(yǎng)以后（p＜0.01），但受體NKG2A及NKG2C 頻率增加，高于健康對(duì)照組（p＜0.05）。
　　 非持續(xù)應(yīng)答組細(xì)胞體外培養(yǎng)后，NK 細(xì)胞分泌IFN-γ及TNF-α均低于健康對(duì)照組培養(yǎng)后（p＜0.05）。
　　 3.慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者血清病毒滴度及ALT 水平與NK 細(xì)胞功能無(wú)相關(guān)性。
　　 4.慢性丙肝患者治療過(guò)程中NK 細(xì)胞、亞型及表面受體的頻率和功能活性變化：
　　 （1）

8、低病毒載量及非基因1 型患者CD56 dim NK 細(xì)胞頻率下降，CD56 bright NK 細(xì)胞頻率增加。（2）低病毒載量及非基因1 型患者抑制性受體NKG2A 頻率增加，高病毒載量及基因1 型患者活化性受體NKG2D 減少。
　　 （3）高病毒載量及基因1 型患者NK 細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ，TNF-α能力下降。
　　 結(jié)論：
　　 1.NK 細(xì)胞功能與HCV 感染及治療后轉(zhuǎn)歸有關(guān)，慢性HCV 感染者體

9、內(nèi)NK 細(xì)胞功能受損，自發(fā)恢復(fù)者及治療持續(xù)應(yīng)答患者NK 細(xì)胞活性高于慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者。
　　 2.慢性丙肝患者體內(nèi)外NK 細(xì)胞功能與健康人存在差別。
　　 3.慢性丙肝患者及非持續(xù)應(yīng)答患者血清病毒滴度、ALT水平與NK細(xì)胞功能無(wú)相關(guān)性。
　　 4.與低病毒載量及非基因1型患者相比，高病毒載量及基因1型患者在抗病毒治療過(guò)程中NK 細(xì)胞功能活性沒(méi)有得到改善甚至降低。
　　 本課題的創(chuàng)新點(diǎn)：

10、　　 1.比較系統(tǒng)地研究了NK 細(xì)胞功能活性與HCV 感染及治療后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系。
　　 2.對(duì)丙肝患者體內(nèi)外NK 細(xì)胞功能的對(duì)比研究有助于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)NK 細(xì)胞功能與HCV感染的關(guān)系。
　　 3.動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)丙肝患者抗病毒治療過(guò)程中NK 細(xì)胞功能的變化，以期預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的應(yīng)答及治療后的轉(zhuǎn)歸。
　　 本課題研究的意義：
　　 1.研究結(jié)果顯示NK 細(xì)胞功能對(duì)HCV 感染后轉(zhuǎn)歸及抗病毒治療效果均有直接影響，有助于