Ca2+-CaN-NFAT信號途徑在Mfn2調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能中作用.pdf

1、目的:線粒體融合蛋白2(Mfn2)作為線粒體外膜上了一種跨膜GTP酶，除了介導(dǎo)線粒體融合外，還參與了細(xì)胞能量代謝、增殖及凋亡等眾多細(xì)胞生物學(xué)過程;Ca2+-CaN-NFAT信號通路在T細(xì)胞的增殖、分化等生命過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，同時Mfn2對維持T細(xì)胞活化過程中的鈣離子信號有重要作用。前期實驗證明，HMGB1能夠時間/劑量依賴性的抑制T淋巴細(xì)胞的免疫功能，同時抑制Mfn2的表達(dá);過表達(dá)MFN2能夠減輕HMGB1的抑制效應(yīng)，并且其機制可能是

2、通過Ca2+-NFAT信號通路而實現(xiàn)。然而，Mfn2調(diào)節(jié)T淋巴細(xì)胞功能的具體機制尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建攜帶Mfn2基因及其干擾序列的慢病毒載體（LV-Mfn2及LV-Mfn2RNAi）轉(zhuǎn)染T淋巴細(xì)胞系，探索Mfn2對T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及Ca2+-CaN-NFAT信號通路在該過程中的作用。
　　 方法:體外培養(yǎng)人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat細(xì)胞，用含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/m

3、l，然后接種于6孔板，對其進(jìn)行慢病毒轉(zhuǎn)染后進(jìn)行效果驗證，符合要求后進(jìn)行分組，在0h，6h，12h，24h，48h時間點處用濃度為50ng/ml PMA/1uM Ionomycin進(jìn)行刺激。實驗一:在上述不同時間點使用P/I進(jìn)行刺激，MTT法檢測Jurkat T淋巴細(xì)胞增殖，ELISA檢測細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ的表達(dá)，分析時間效應(yīng)關(guān)系;同時采用流式細(xì)胞術(shù)Fluo-3AM檢測胞漿鈣離子水平，Western blo

4、t法檢測CaN的改變，ELISA法檢測NFAT活化情況，觀察調(diào)節(jié)Mfn2的表達(dá)對Ca2+-CaN-NFAT信號通路各個環(huán)節(jié)的影響。實驗二:根據(jù)以上結(jié)果找出最佳刺激時間點，然后分別使用LV-CAN和終濃度為20ng/ml的FK506來調(diào)節(jié)CAN的表達(dá)，在該時間點下分別采用MTT法檢測JurkatT淋巴細(xì)胞增殖，ELISA檢測細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-2，IL-4，IFN-γ的表達(dá)，觀察改變CAN的表達(dá)對Mfn2引起T細(xì)胞免疫功能變化的影響

5、。Western blot法驗證各組CAN的改變，并且采用ELISA法檢測NFAT活化情況，明確CAN在該信號通路中的關(guān)鍵地位。
　　 結(jié)果:
　　 1.調(diào)節(jié)Mfn2的表達(dá)對T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響及信號機制的探究：(1)慢病毒載體驗證結(jié)果顯示，LV-Mfn2RNAi-RFP組mRNA和Mfn2蛋白表達(dá)明顯下調(diào);反之，LV-Mfn2-GFP組mRNA和Mfn2蛋白表達(dá)明顯升高。(2)Mfn2干擾組在P/I刺激劑作用24h

6、增殖能力，細(xì)胞上清液中IL-2的水平，細(xì)胞因子IFN-γ/IL-4比值明顯抑制; Mfn2過表達(dá)組細(xì)胞在P/I刺激劑作用24h上述指標(biāo)顯著增加。(3) Mfn2干擾組24hT細(xì)胞胞漿鈣離子水平，CAN的表達(dá)，核轉(zhuǎn)錄因子NFAT活性明顯低于對照組及空載體組;Mfn2過表達(dá)組細(xì)胞在刺激24h上述指標(biāo)顯著增加。
　　 2.調(diào)節(jié)CaN的活性對Mfn2改變T細(xì)胞功能的影響及NFAT的變化：(1)上調(diào)CAN的表達(dá)對抑制Mfn2表達(dá)后T淋巴細(xì)

7、胞增殖功能、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值降低的影響:MFN2干擾組細(xì)胞增殖程度、IL-2分泌水平、IFN-γ/IL-4比值較空載體組明顯降低;轉(zhuǎn)染LV-CAN使鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)升高之后，被抑制的細(xì)胞增殖、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值可被逆轉(zhuǎn)。(2)抑制CAN的活性(FK-506)對上調(diào)Mfn2表達(dá)后T淋巴細(xì)胞增殖功能、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值升高的影響:Mfn2過表達(dá)組細(xì)胞增殖程度，IL-2水平，IFN-

8、γ/IL-4比值較空載體組顯著增高;當(dāng)使用FK506降低CAN的表達(dá)后，升高的細(xì)胞增殖、IL-2分泌、IFN-γ/IL-4比值可被逆轉(zhuǎn)。(3)轉(zhuǎn)染LV-CAN對下調(diào)Mfn2表達(dá)后CAN、NFAT表達(dá)下降的影響:Mfn2干擾組CAN表達(dá)，NFAT活性較空載體組明顯降低;轉(zhuǎn)染LV-CAN使鈣調(diào)磷酸酶表達(dá)升高，被抑制的CAN表達(dá),NFAT在一定程度上可被逆轉(zhuǎn)。(4)抑制CAN的活性(FK-506)對上調(diào)Mfn2表達(dá)后T細(xì)胞CAN、NFAT活性

9、升高的影響: Mfn2過表達(dá)組CAN表達(dá),NFAT活性較空載體組組明顯升高，當(dāng)使用FK506降低CAN的表達(dá)，升高的CAN的表達(dá)，NFAT活性明顯受到抑制。
　　 結(jié)論:
　　 1.上調(diào)Mfn2表達(dá)能夠增強T淋巴細(xì)胞增殖能力，IL-2的分泌，增強T細(xì)胞的免疫功能;并且Mfn2表達(dá)增加能夠顯著提高胞漿Ca2+，CAN及NFAT的表達(dá)，反之干擾MFN2表達(dá)效應(yīng)完全相反。提示Mfn2可能在膿毒癥功能免疫紊亂中占有一席之地，并且