高遷移率族蛋白B1倡導(dǎo)T細(xì)胞免疫反應(yīng)的信號(hào)機(jī)制及其與Mfn2的關(guān)系.pdf

1、目的:高遷移率族蛋白B1(HMGB1)作為一種晚期炎癥因子和免疫調(diào)節(jié)分子，與膿毒癥免疫紊亂發(fā)生密切相關(guān)，研究其免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)及機(jī)制將有助于深化對(duì)膿毒癥致病機(jī)制的認(rèn)識(shí)。新近發(fā)現(xiàn)，HMGB1對(duì)胞內(nèi)信號(hào)蛋白-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase，MAPK)的活化具有重要調(diào)控作用，而MAPK參與了T淋巴細(xì)胞增殖、活化和分化等過(guò)程。線粒體融合蛋白2(mitofusin-2，Mfn2)是線粒體塑形蛋白的一員

2、，除介導(dǎo)線粒體融合作用外，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、能量代謝、增殖及凋亡等生命過(guò)程中均有重要調(diào)節(jié)作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)Mfn2能夠改善HMGB1誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞免疫功能抑制狀態(tài)，但其中的確切機(jī)制還不清楚。本項(xiàng)目通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)研究MAPK在HMGB1誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫功能改變中的作用，并通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)Mfn2表達(dá)，探討Mfn2在HMGB1調(diào)控T細(xì)胞免疫功能中的作用及其對(duì)MAPK活化的影響。
　　 方法：體外培養(yǎng)人T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)

3、胞系Jurkat細(xì)胞，在含10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/ml后培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，首先用濃度為50ng/mlPMA和1uM的Ionomycin刺激12小時(shí)，在不同時(shí)間點(diǎn)加入不同劑量HMGB1。
　　 實(shí)驗(yàn)一：應(yīng)用HMGB1刺激，MTT法檢測(cè)Jurkat淋巴細(xì)胞的增殖反應(yīng)，ELISA法檢測(cè)IL-2、IL-4、IFN-γ蛋白的表達(dá)，分析時(shí)間/劑量效應(yīng)關(guān)系。
　　 實(shí)驗(yàn)二：根據(jù)以上結(jié)果找出最

4、佳刺激劑量，在該劑量HMGB1刺激不同時(shí)間分別用ELISA法檢測(cè)ERK1/2、JNK、P38以及NFAT的活化情況；采用相應(yīng)MAPK特異性拮抗劑阻斷MAPK的活化，觀察HMGB1誘導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞功能改變及NFAT活性變化。
　　 實(shí)驗(yàn)三：采用實(shí)驗(yàn)一相同時(shí)間點(diǎn)，應(yīng)用HMGB1刺激，Western-blot和Realtime-PCR法檢測(cè)Mfn2蛋白及mRNA的表達(dá)；通過(guò)基因轉(zhuǎn)染技術(shù)調(diào)節(jié)Mfn2表達(dá)，然后給予HMGB1刺激，觀察細(xì)胞

5、增殖反應(yīng)及IL-2蛋白表達(dá)、IFN-γ/IL-4的變化以及ERK1/2、JNK、P38以及NFAT的活化情況。
　　 結(jié)果：
　　 1．MAPK在HMGB1誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫功能改變中的作用：(1)與正常對(duì)照組相比，100ng/ml、1000ng/ml劑量的HMGB1作用24h或48h后，T細(xì)胞增殖能力低下(P＜0.05或P＜0.01)、IL-2產(chǎn)生受到抑制(P＜0.01)，Th2細(xì)胞因子比例增加(IFN-γ/IL-4比

6、值減小(P＜0.05或P＜0.01)。(2)100ng/ml劑量HMGB1刺激后，ERK1/2和P38磷酸化水平較正常對(duì)照組均顯著升高，其中ERK1/2在1h活化最明顯(P＜0.01)，P38磷酸化在15min時(shí)達(dá)到高峰(P＜0.01)，而JNK磷酸化無(wú)明顯影響(P＞0.05)。(3)預(yù)先分別采用SuM的ERK1/2、P38特異性阻斷劑U0126、SB203580孵育T細(xì)胞，然后予以100ng/mlHMGB1刺激24h，U0126和SB

7、203580均能部分改善HMGB1誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫功能抑制狀態(tài)，即與單純HMGB1刺激組相比，HMGB1+U0126組T細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，IL-2產(chǎn)生增加和IFN-γ/IL-4比值上升(P＜0.05)；HMGB1+SB203580組T細(xì)胞IL-2分泌增多和IFN-γ/IL-4比值上升(P＜0.05)，但T細(xì)胞增殖無(wú)明顯改變(P＞0.05)。(4)HMGB1對(duì)T淋巴細(xì)胞NFAT的活化具有抑制作用，而U0126和SB203580預(yù)處理后能明

8、顯改善HMGB1誘導(dǎo)的NFAT活性抑制狀態(tài)(P＜0.05或P＜0.01)。(5)5uM的U0126、SB203580預(yù)處理Jurkat細(xì)胞后并未完全阻斷HMGB1誘導(dǎo)的ERK1/2、P38磷酸化，與P/I組相比，ERK1/2和P38仍存在一定程度活化(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2．Mfn2在HMGB1介導(dǎo)T淋巴細(xì)胞免疫功能改變中的作用及其對(duì)MAPK活化的影響：(1)與正常組相比，PMA/Ionomycin刺激后Mfn

9、2mRNA及蛋白的表達(dá)有所增強(qiáng)；與P/I組比較，10ng/mlHMGB1刺激24h后Mfn2mRNA表達(dá)改變并不明顯，而100ng/ml、1000ng/mlHMGB1刺激后明顯下降(P＜0.05或P＜0.01)；100ng/mlHMGB1刺激24h或48h，Mfn2的表達(dá)量顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)。(2)與P/I組比較，在未給予HMGB1刺激的情況下，過(guò)表達(dá)Mfn2導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力明顯下降(P＜0.01)、IL-2產(chǎn)生下降

10、(P＜0.05)，而IFN-γ/IL-4比值無(wú)明顯改變；但過(guò)表達(dá)Mfn2能明顯減輕HMGB1誘導(dǎo)的T細(xì)胞免疫功能抑制狀態(tài)，即與HMGB1刺激組比較，HMGB1+Lv-Mfn2組細(xì)胞增殖反應(yīng)增強(qiáng)(P＜0.05)、IL-2分泌增加(P＜0.05)，IFN-γ/IL-4比值升高(P＜0.05)。(3)與HMGB1組相比，過(guò)表達(dá)Mfn2并沒(méi)有明顯改變HMGB1誘導(dǎo)的ERK1/2、P38的磷酸化水平(P＞0.05)。(4)在未給予HMGB1刺激的

11、情況下，過(guò)表達(dá)Mfn2導(dǎo)致細(xì)胞NFAT活性下降(P＜0.01)；但與HMGB1組相比，過(guò)表達(dá)Mfn2能夠部分減輕HMGB1對(duì)NFAT活性抑制作用(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1．HMGB1對(duì)T細(xì)胞增殖和細(xì)胞因子分泌等免疫功能均有直接調(diào)節(jié)效應(yīng)；HMGB1能以時(shí)間/劑量依賴性抑制T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)、IL-2分泌和出現(xiàn)Th2相關(guān)免疫反應(yīng)，且這一過(guò)程至少部分是與ERK1/2、P38的過(guò)度磷酸化及其下游轉(zhuǎn)錄因子NFAT活