Bacillus litoralis C44α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.pdf

1、以蘆丁為底物，利用α-L-鼠李糖苷酶生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)異槲皮素成為當(dāng)今研究的熱點(diǎn)。但迄今為止發(fā)現(xiàn)的α-L-鼠李糖苷酶產(chǎn)生菌都有β-D-葡萄糖苷酶與(或)蕓香糖苷酶活性，致使其專一性很差，產(chǎn)物中常含大量槲皮素等成分，給分離純化造成困難的同時(shí)，也降低了異槲皮素的收率。
　　本研究以本實(shí)驗(yàn)室前期篩選得到的能特異高效水解蘆丁為異槲皮素的岸濱芽孢桿菌(Bacillus litoralis) C44為實(shí)驗(yàn)對象，通過全基因組測序來發(fā)掘其潛在的α-L

2、-鼠李糖苷酶基因、β-D-葡萄糖苷酶基因和蕓香糖苷酶基因，實(shí)現(xiàn)這些基因的克隆及原核表達(dá)。通過對重組蛋白進(jìn)行分離純化、活性檢測、酶學(xué)性質(zhì)測定等方法來闡明C44菌株專一轉(zhuǎn)化蘆丁為異槲皮素的作用機(jī)制，從而為促進(jìn)該酶在生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)異槲皮素中應(yīng)用，降低異槲皮素生產(chǎn)成本奠定基礎(chǔ)。
　　分析C44菌株基因組測序結(jié)果，得到4個(gè)潛在編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因：rha1、rha2、rha3和rha4，其大小分別為2859 bp、2910 bp、2

3、712 bp、1572 bp。同時(shí)發(fā)現(xiàn)C44編碼3個(gè)β-D-葡萄糖苷酶基因，不編碼蕓香糖苷酶基因。Bacillus litoralis C44的3個(gè)β-D-葡萄糖苷酶基因克隆、表達(dá)后，經(jīng)測定沒有特異或非特異水解蘆丁的能力。
　　分別將4個(gè)α-L-鼠李糖苷酶基因(rha)進(jìn)行 T克隆并構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a(+)-rha，經(jīng)誘導(dǎo)，各基因在E.coli BL21(DE3)中編碼的酶蛋白（RHA）大小分別為：112.468 KD

4、，110.67 KD，106.764 KD，64.595 KD。當(dāng)菌液OD600為0.6時(shí)，加入0.2 mmo l/L的IPTG，37℃下誘導(dǎo)5 h，則各重組蛋白表達(dá)量占總蛋白的10.13％，18.016%，19.36%，35.258%。
　　在含6%甲醇(V/V)，pH7.0的0.1 mol/L PBS緩沖液中，分別用含有重組蛋白的破碎全菌液轉(zhuǎn)化終濃度為3 mg/mL的蘆丁，經(jīng)TLC檢測，發(fā)現(xiàn)僅rha4編碼蛋白(RHA4)具有活

5、性。對其進(jìn)行Ni-NTA親和純化，回收濃度為0.335mg/mL，收率為15.59%。
　　RHA4在50℃，pH8.0的Atkins-Pantin緩沖液中水解蘆丁效果最好；在此條件下，20 mg的破碎菌體，3 h可轉(zhuǎn)化約1.8 mg底物且沒有副產(chǎn)物的產(chǎn)生。以pNP-α-L-鼠李糖苷為底物測定重組酶酶學(xué)性質(zhì)，結(jié)果是：重組酶最適溫度為60℃，于20-55℃使用時(shí)穩(wěn)定；最適pH值是6.0，且僅在p H6.0附近保持穩(wěn)定；在60℃，p